Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

Resumo

Fonte: Tripathi, P. et al., Um Sistema Híbrido de Levedura-um Modificado para Estudos de Interação DNA-Complexo de Proteína Heteromérica. J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de um híbrido de levedura modificado, que detecta várias proteínas interagindo com o DNA alvo. As células de levedura transformadas contêm a sequência de DNA alvo a montante do gene repórter. Além disso, eles expressam proteínas do fator de transcrição. Quando as proteínas formam complexos e se ligam ao DNA alvo, o gene repórter é expresso e pode ser detectado enzimaticamente.

Protocolo

1. Dia 9 (manhã): Iniciar a cultura para medição enzimática.

1. Ressuspenda a cultura e transfira 125 μL usando uma pipeta multicanal em uma placa espectrofotômetro (medida OD₆₀₀).
   nota: Cuidado: Não dispense a última gota para evitar bolhas, se o OD₆₀₀ estiver abaixo de 0,3 - 0,6, incube as células restantes por mais 1 - 2 h com base na leitura. A cultura de 125 μL usada nesta etapa pode ser descartada ou transferida de volta para o bloco de poço profundo original a critério do usuário.
2. Centrifugar as células restantes no bloco de poços profundos durante 10 minutos a 3000 x g e....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa inferior redonda de 96 poços	Greiner bio-one	650101	Artigos de plástico
Bloco de poço de 96 profundidades	EUA Científico	1896-2000	Artigos de plástico
Folha selável	EUA Científico	Rolamento 2923-0110	Artigos de plástico
Araseal	Excel Científico	B-100	Artigos de plástico
2-mercaptoetanol	Fisher Científico	Rolamento 034461-100	Análise
ONPG	Sigma-Aldrich	Rolamento 73660	Análise
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484	Análise
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	Análise
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139	Análise
Kcl	Fisher Científico	BP366-500	Análise
MgSO4	Sigma-Aldrich	Rolamento 83266	Análise
Hcl	Fisher Científico	SA54-4	Análise
Banho seco	Thermo Fischer		dispositivo
vórtice	Thermo Fischer		dispositivo
centrifuga	Eppendorf	Centrífuga 5810R	dispositivo
Leitor de placas	Dispositivo molecular	Espectrofotômetro de microplacas SPECTRAMAX PLUS	dispositivo
incubadora	Thermo Fisher	Informação básica Modelo: 5250-37 graus, 6250-30 graus	dispositivo
Incubadora Shaker	New brunswick		dispositivo
Banho-maria	Thermo Fisher	IsoTemp 205	dispositivo
Base Tris	Fisher Científico	BP152-1	Análise