1. Dia 9 (manhã): Iniciar a cultura para medição enzimática.
- Ressuspenda a cultura e transfira 125 μL usando uma pipeta multicanal em uma placa espectrofotômetro (medida OD600).
nota: Cuidado: Não dispense a última gota para evitar bolhas, se o OD600 estiver abaixo de 0,3 - 0,6, incube as células restantes por mais 1 - 2 h com base na leitura. A cultura de 125 μL usada nesta etapa pode ser descartada ou transferida de volta para o bloco de poço profundo original a critério do usuário.
- Centrifugar as células restantes no bloco de poços profundos durante 10 minutos a 3000 x g e 21 °C. Remover o sobrenadante invertendo.
- Adicione 200 μL de tampão Z e vórtice.
nota: Consulte a receita do Z-buffer na Tabela 1.
- Centrifugue durante 5 min a 3000 x g e 21 °C. Retirar o sobrenadante invertendo.
- Adicione 20 μL de tampão Z e vórtice.
- Cubra a placa com papel alumínio que resista aos ciclos de congelamento e descongelamento. Realizar 4 ciclos de congelamento/descongelamento com azoto líquido em capela e depois 42 ºC em banho-maria (2 min cada).
- Adicione 200 μL de tampão Z / beta-mercaptoetanol (β-ME) / orto-nitrofenil-β-galactosídeo (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg, respectivamente, produzirá 20 mL de solução; sempre prepare fresco).
nota: O ONPG levará algum tempo para se dissolver adequadamente, portanto, prepare a solução uma hora antes de chegar a esta etapa. O ONPG serve como substrato para a medição da atividade da β-galactosidase.
- Incubar até 17 - 24 h a 30 °C (verificar no meio, se a cor se desenvolver mais cedo, prossiga para o passo seguinte).
2. Dia 10 (manhã): Pare a reação e meça.
- Adicione 110 μL 1M Na2CO3 para interromper a reação e registrar o tempo.
- Vórtice e centrifugação por 10 min a 3000 x g e 21 °C.
- Pegue 125 μL de sobrenadante usando multicanal e meça OD420.
nota: Cuidado, não dispense a última gota para evitar bolhas.
Tabela 1: A receita para as soluções usadas no protocolo. A tabela fornece a receita para as soluções de estoque e de trabalho dos principais tampões usados no ensaio.
| Tampão TE 10X (10ml) | |
| desejável | Do estoque |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8,0) | 1mL de Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH 8,0) | 200uL de EDTA 0,5M |
| Completar o volume com água | |
| TE/LiAc (10ml) | |
| desejável | Do estoque |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0,1 milhão de LiAc | 1mL LiAc 1M |
| Completar o volume com água | |
| TE/LiAc/PEG (50 mL) 50% | |
| desejável | Do estoque |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| 0,1 milhão de LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 mL PEG3350 | |
| Tampão Z (1L) pH 7,0 | |
| Na2HPO4 16,1g de heptahidratado ou 8,52g de anidro |
| NaH2PO4 5,5g de hidratado ou 4g de anidro |
| KCl 0,75g |
| MgSO4 0,246g de hidratado ou 0,12g de anidro |
| Manter o pH com HCl |
| Todas as soluções são esterilizadas antes do uso. |
| Placas de meio e ágar utilizadas no protocolo (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura e SD-Trp-Ura) seguem a mesma receita do Y1H |
