Medição da atividade helicase de uma proteína-alvo usando duplexes de RNA marcados com biotina

Resumo

Fonte: Yu, L. et al., Ensaios bioquímicos in vitro usando marcadores de biotina para estudar interações proteína-ácido nucleico. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para determinar a atividade helicase de uma proteína-alvo para desenrolar o substrato dsRNA marcado com biotina. A atividade da enzima foi identificada pela análise do deslocamento da mobilidade eletroforética, seguida por um ensaio de quimioluminescência usando estreptavidina conjugada com enzima quimioluminescente.

Protocolo

1. Preparação de proteínas

1. Construções de expressão MOV10
   1. Gerar construções de expressão de cDNA que codificam MOV10 de camundongo.
      1. Configure as reações de reação em cadeia da polimerase (PCR) para cada fragmento. Misture 1 μL de cDNA de camundongo (de testículo de camundongo C57BL/6), 1 μL de dNTP, 2 μL de primer direto de 10 μM, 2 μL de primer reverso de 10 μM, 1 μL de DNA polimerase, 25 μL de tampão de PCR 2x e 18 μL de H₂O (ddH₂O) em um volume final de 50 μL.
         nota: Os primers para a amplificação de fragmentos do gene Mov10 estão listados na Tabela 1.
      2. Realize reações de PCR usando os seguintes programas: 95 ° C por 5 min, 35 ciclos de aquecimento a 95 ° C por 15 s, recozimento a 64 ° C por 15 s, extensão a 72 ° C por 20 s (2 min para estender MOV10 de comprimento total) e extensão final a 68 ° C por 7 min.
   2. Analise o DNA de PCR amplificado por eletroforese em gel, corte a banda do tamanho necessário do gel rapidamente sob uma lâmpada UV e coloque-a em um tubo de centrífuga.
      nota: O tamanho esperado do produto visível no gel de agarose para MOV10 é de 3015 pb.
   3. Purifique o DNA de PCR com um kit de extração em gel seguindo o protocolo do fabricante.
      1. Adicione um volume igual de tampão de dissolução no tubo de centrífuga da etapa 1.1.2 e derreta o gel em banho-maria a 50-55 °C por 5-10 min, garantindo que os pedaços de gel derretam completamente. Centrifugue brevemente para coletar quaisquer gotículas da parede do tubo.
         nota: A concentração mássica/volumétrica do gel e do tampão de dissolução é de 1 mg/μL.
      2. Colocar a coluna de adsorção no tubo de recolha, transferir a solução que contém o fragmento de gel dissolvido para a coluna de adsorção e centrifugar a 12.000 x g durante 2 min.
      3. Rejeitar o filtrado no fundo dos tubos de recolha. Adicione 600 μL do tampão de lavagem à coluna, centrifugue a 12.000 x g por 1 min e descarte o filtrado.
      4. Repita a etapa 1.1.3.3 uma vez.
      5. Coloque a coluna de volta no tubo de coleta e centrifugue a 12.000 x g por 2 min para remover todo o tampão de lavagem restante.
      6. Coloque a coluna de adsorção em um tubo de centrífuga esterilizado de 1,5 mL, adicione 50 μL de ddH₂O ao centro da coluna de adsorção e centrifugue a 12.000 x g por 1 min. Meça a concentração de DNA do eluato usando um espectrofotômetro.
   4. Digestão de restrição de plasmídeos
      1. Digerir o vetor pRK5 com BamHI e XhoI misturando 4 μg de vetor pRK5, 5 μL de tampão de digestão 10x, 1 μL de BamHI e 1 μL de XhoI e ddH₂O até um volume de reação final de 50 μL. Incubar a 37 °C por 2 h.
   5. Analise o DNA do vetor por eletroforese em gel, corte rapidamente a faixa de tamanho desejado do gel com um bisturi sob uma lâmpada UV e coloque-a em um tubo de centrífuga.
   6. Purificar o ADN do vector com um kit de extracção em gel como o ponto 1.1.3, seguindo as instruções do fabricante.
   7. Configure uma reação de ligação recombinante padrão combinando 0,03 pmol de vetor linearizado, 0,06 pmol de fragmento de cDNA, 2 μL de ligase e 4 μL de tampão ligase 5x e ddH₂O em um volume de reação final de 10 μL.
      nota: Clone MOV10 em um vetor pRK5.
   8. Incubar a mistura a 37 °C durante 30 min e, em seguida, arrefecer imediatamente a reação durante 5 min no gelo. Transforme plasmídeos recombinantes MOV10 em bactérias DH5α.
      nota: Verifique todas as construções recombinantes por sequenciamento de Sanger.
   9. Preparar estoques de glicerol de culturas bacterianas contendo plasmídeos recombinantes verificados, adicionando um volume igual de 50% de glicerol às culturas líquidas e armazenando a -80 °C.
      nota: Para cada experimento subsequente, retire as bactérias dos estoques de glicerol em uma placa de ágar fresco e use uma única colônia para a expansão, conforme descrito na etapa 1.2.
2. Extratos de proteína MOV10 de células HEK293T
   1. Expressam transitoriamente as proteínas MOV10 em células HEK293T cultivadas.
      1. Preparar o plasmídeo MOV10-pRK5 a uma concentração >500 ng/μl.
      2. Semeie HEK293T células em placas de 15 cm. Quando a densidade celular atingir ~ 70% -90%, substitua o meio de cultura celular por meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) fresco contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
      3. Para uma transfecção, dilua 60 μg de DNA de plasmídeo MOV10-pRK5 em 3 mL do meio de soro reduzido, adicione 120 μL do reagente intensificador de transfecção e misture bem.
      4. Em um tubo separado, diluir 90 μL do reagente de transfecção com 3 mL de meio sérico reduzido (sem penicilina-estreptomicina) e misturar bem.
      5. Adicione o DNA diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
      6. Adicione a mistura de transfecção à cultura de células e cultive as células por ~ 36-48 h.
   2. Após 36-48 h, colete as células de cada placa em um tubo de 50 mL. Centrifugue a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Lave cada pellet com 10 mL de PBS gelado e colete as células por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
   3. Ressuspenda o pellet em 3 mL de tampão de lise celular contendo um coquetel completo de inibidores de protease livre de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incube por 30 min no gelo. Centrifugar o lisado a 20.000 x g e 4 °C durante 20 min.
   4. Adicione 100 μL de esferas magnéticas anti-FLAG por prato de células em um tubo de 1,5 mL.
   5. Lave as esferas magnéticas 2x com tampão K150 (50 mM HEPES a pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0.1% NP-40).
      1. Ressuspenda as esferas magnéticas em 1 mL de tampão K150 gelado.
      2. Incube as esferas magnéticas por 2 min a 4 °C com rotação suave e peletize as esferas magnéticas com a ajuda de um ímã. Remova e descarte o sobrenadante.
   6. Adicionar os grânulos magnéticos ao sobrenadante do lisado celular do passo 1.3.3 e incubar a 4 °C durante 2 h.
   7. Lave as esferas magnéticas ligadas à proteína 3x com tampão K150, depois 2x com K150 contendo 250 mM NaCl e, em seguida, 3x com tampão K150 como 1.3.5.
   8. Ressuspenda os grânulos em 300 μL de tampão de eluição FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 10% de glicerol), adicione o peptídeo FLAG a uma concentração final de 0,5 μg / μL e incube com grânulos em um rotador a 4 ° C por 1 h, depois pegue os grânulos magnéticos com a ajuda de um ímã.
   9. Recolher o sobrenadante que contém as proteínas MOV10 eluídas, determinar a concentração e conservá-lo a -80 °C para utilização futura.

2. Preparação de ácidos nucleicos

1. Compre oligonucleotídeos de DNA e RNA (oligos) com ou sem marcadores de biotina de uma fonte adequada. Diluir cada oligo em ddH₂O isento de RNase a 20 μM e mantê-lo a -80 °C para uso futuro.
   nota: As sequências oligo de substratos de DNA/RNA usadas neste estudo estão listadas na Tabela 2.
2. Prepare a seguinte mistura para a reação de recozimento de RNA de fita dupla (dsRNA) para o ensaio de atividade MOV10 helicase: misture 60 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-etano-sulfônico (HEPES) a pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl₂ e ddH₂O livre de RNase em um volume de reação final de 20 μL.
3. Recozer oligos de RNA para formar RNA duplex aquecendo uma mistura da fita superior marcada com biotina (2 μM, concentração final) e 1,5 vezes de sua fita inferior complementar não marcada no tampão de recozimento (etapa 2.2) a 95 ° C por 5 min e, em seguida, resfrie-o lentamente à temperatura ambiente (RT).

3. Ensaios bioquímicos in vitro

1. EMSA e reações enzimáticas
   1. Para o ensaio de atividade MOV10 helicase, misturar 50 mM Tris-HCl a pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl₂, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL inibidor de RNase, substrato de RNA marcado com biotina 10 nM, 2 mM de adenosina trifosfato (ATP), 100 nM de armadilha de RNA e 20 ng de proteína MOV10 e ddH₂O num volume final de reação de 20 μL. Incubar a mistura de reação a 37 °C durante 10 min, 30 minutos e 60 minutos. Adicione o buffer de parada 5x para interromper a reação.
      nota: Armadilha de RNA, um oligo não marcado com biotina com sequência, complementaridade ao oligo marcado, o que impede que o dsRNA desenrolado recoze novamente.
2. Géis de poliacrilamida
   1. Lave as placas de gel (16 cm x 16 cm) e os pentes de 1,5 mm. Monte as unidades de eletroforese em gel.
   2. Para preparar um gel de poliacrilamida nativo a 10%, misture 14 mL de ddH₂O, 1,25 mL de ácido trisbórico 10x-EDTA (TBE), 8,3 mL de acrilamida a 30%, 1,25 mL de glicerol a 50%, 187,5 μL de persulfato de amônio a 10% recém-preparado (APS) e 12,5 μL de tetrametiletilenodiamina (TEMED).
   3. Para preparar um gel de poliacrilamida nativa a 20%, misture 5,5 mL de ddH₂O, 1,25 mL de 10x TBE, 1,25 mL de glicerol a 50%, 16,7 mL de acrilamida a 30%, 187,5 μL de APS a 10% e 12,5 μL de TEMED.
   4. Despeje a solução de acrilamida imediatamente no gel e insira o pente. Deixe a mistura polimerizar por aproximadamente 30 min.
3. Gel running
   1. Remova o pente e encha os tanques com o tampão de eletroforese (0,5x TBE).
   2. Enxágue os poços de amostra com tampão TBE 0,5x e, em seguida, pré-execute o gel a 100 V no gelo por 30 min. Substitua o tampão de corrida por TBE 0,5x novo.
   3. Carregue amostras de 20-25 μL em cada poço.
   4. Use um gel de acrilamida nativa a 10% para o ensaio EMSA e um gel de acrilamida nativa a 20% para os ensaios enzimáticos. Execute a eletroforese a 100 V no banho de gelo até que o marcador azul de bromofenol tenha migrado para o quarto inferior do gel.
4. Desmonte as placas de gel e apare o gel removendo os poços de carregamento e as pistas não utilizadas. Coloque o gel em tampão TBE 0,5x.
5. Corte o papel de filtro e a membrana de náilon no tamanho do gel. Molhe previamente o papel de filtro limpo e a membrana de náilon.
6. Monte a pilha para transferência.
   1. Coloque a membrana pré-umedecida no papel de filtro pré-úmido.
   2. Coloque o gel na membrana.
   3. Cubra o gel com outra camada de papel de filtro pré-úmido.
   4. Remova todas as bolhas de ar rolando uma pipeta limpa do centro para a borda.
7. Transferir as amostras do gel para a membrana num aparelho electroforético semi-seco a 90 mA durante 20 min.
8. Pare a transferência e seque a membrana em um novo papel de filtro por 1 min.
9. Reticule as amostras irradiando a membrana a 120 mJ/^cm2 por 45-60 s em um reticulador de luz UV equipado com lâmpadas de 254 nm (função de reticulação automática). Seque a membrana ao ar em RT por 30 min.
10. Detecção de quimioluminescência
    1. Protocolo 1: Use um volume padrão de kit comercial de detecção de ácido nucleico quimioluminescente.
       1. Adicione 20 mL de tampão de bloqueio à membrana e incube por 15-30 min com agitação suave em um rotador a 20-25 rpm.
       2. Prepare a solução conjugada / tampão de bloqueio adicionando 66,7 μL de conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano estabilizado a 20 mL de tampão de bloqueio.
       3. Remova cuidadosamente o buffer de bloqueio e substitua-o por buffer conjugado/bloqueador. Incube por 15 min em um rotador a 20-25 rpm.
       4. Lave a membrana 4x agitando a 40-45 rpm por 5 min cada.
       5. Adicione 30 mL de tampão de equilíbrio de substrato à membrana. Incube a membrana por 5 min agitando a 20-25 rpm.
       6. Prepare a solução de trabalho do substrato adicionando 6 mL de solução de luminol / intensificador a 6 mL de solução de peróxido estável. Evite a luz.
       7. Cubra toda a superfície da membrana com solução de trabalho de substrato e incube por 5 min.
       8. Escaneie a membrana em um sistema de imagem quimioluminescente por 1-3 s.

Tabela 1: Os primers usados para PCR amplificam os fragmentos gênicos de Meiob e Mov10.As letras em negrito nos primers para frente e para trás são locais de corte BamHI e NotI; as letras em negrito em itálico em um primer reverso são locais de corte XhoI; as letras em negrito nas caixas indicam os nucleotídeos correspondentes à mutação pontual R235A.

Fragmentos	Primers	Sequências (de 5' a 3')
MEIOB-A	encaminhar	CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	inverter	EMGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	encaminhar	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	inverter	CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	encaminhar	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	inverter	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	encaminhar	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	inverter	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	encaminhar	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	inverter	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

Tabela 2: Sequências de substratos de DNA/RNA utilizados neste trabalho.

Para números	Nomes	Sequências (de 5' a 3')
Figura 2, 5	36 nt ssDNA	5'-Biotina-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA)
Figura 3	36 nt ssRNA	5'-Biotina-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUG-3' (RNA)
Figura 4	54 nt dsRNA de 5 'cauda	5'-Biotina-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
equipamento
centrifuga	Eppendorf, Alemanha	5242R
Sistema de imagem quimioluminescente	Tanon, China	5200
Sonifer digital	Branson, EUA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 Hz
Mata-borrão eletroforético semi-seco	Hoefer, EUA	TE77XP
revólver de tubo	Crystal, EUA	3406051
Reticulador com luz UV	UVP, EUA	CL-1000
materiais
Membrana de nylon	Thermo Scientific, EUA	TG263940A
Prato de cultura tratado com TC	Corning, EUA	430167	100 milímetros
Prato de cultura tratado com TC	Corning, EUA	430597	150 milímetros
Tubos de microtubos	AXYGEN, EUA	MCT-150-C	1,5 mL
Tubos	Corning, EUA	430791	15 mL
Reagentes
Contas magnéticas Anti-FLAG M2	Sigma, EUA	M8823
ATP	Thermo Scientific, EUA	591136
Kit de desenvolvimento de cor de fosfatase alcalina BCIP / NBT	Beyotime, China	C3206
Reagente de lise de células CelLyticTM M	Sigma, EUA	107M4071V
Kit de clonagem de uma etapa ClonExpress II	Vazyme, China	C112
Kit de Detecção de Ácido Nucleico Quimioluminescente	Thermo Scientific, EUA	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, EUA	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, EUA	10569044
Edta	Invitrogen, EUA	AM9260G	0,5 m
Coquetel de inibidores de protease sem EDTA	Roche, EUA	4693132001
Kit de plasmídeo EndoFree Maxi	Vazyme, China	DC202
Mini kit de extração de DNA em gel FastPure	Vazyme, China	DC301-01
FBS	Gibco, EUA	10437028
Peptídeo FLAG	Sigma, EUA	Rolamento F4799
Glicerol	Sigma, EUA	SHBK3676
Buffer HEPES	Sigma, EUA	SLBZ2837	1 milhão
KOAc	Sangon Biotech, China	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, EUA	AM9530G	1 milhão
NaCl	Invitrogen, EUA	AM9759	5 milhões
NP-40	Amresco, EUA	M158-500ML
Meio Opti-MEM	Gibco, EUA	31985062
Pbs	Gibco, EUA	10010023	pH 7,4
Inibidor de RNase	Promega, EUA	N251B
Estreptavidina fosfatase alcalina	Promega, EUA	V5591
TBE	Invitrogen, EUA	15581044
Tampão Tris-HCI	Invitrogen, EUA	15567027	1 m, pH 7,4
Tampão Tris-HCI	Invitrogen, EUA	15568025	1 m, pH 8,0
Interpolação-20	Sangon Biotech, China	A600560