Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

Resumo

Fonte: de la Peña Avalos, B., et al., Visualização da interação das proteínas de reparo do DNA por imunofluorescência. J. Vis. Exp. (2020).

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Protocolo

1. Extracção nuclear e fixação celular

1. Prepare soluções de estoque: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacarose, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
2. Prepare o tampão de extração nuclear (NEB): dissolva 10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (pH 8,0) e 0,5% (v/v) Triton X-100 em ddH₂O. Misture até dissolver completamente.
3. Prepare paraformaldeído (PFA) a 4% (v/v): dissolva 10 mL de solução aquosa de PFA a 16% em 30 mL de PBS. Misture até dissolver completamente.
4. No momento apropriado (t = 0, 1, 2, 4, 16 h), lave as células duas vezes com 1 mL de PBS. Remova o PBS completamente.
5. Adicionar 200 μL de NEB a cada poço para extração de núcleos celulares (o citoplasma está degradado, resta apenas o núcleo) (Figura 1). Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente e remover completamente.
   nota: Não exceda 2 minutos.
6. Lave as células com 1 mL de PBS. Remova o PBS completamente. Adicione PBS com cuidado, as células são muito frágeis nesta etapa.
7. Adicione 200 μL de PFA a 4% (v / v) a cada poço para fixação celular. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Remover completamente o PFA.
8. Adicione 1 mL de PBS.
   nota: As células podem ser armazenadas em PBS a 4 °C.

2. Coloração por imunofluorescência

1. Prepare a solução de bloqueio: dissolva 5% de BSA (p / v) em PBS e adicione 0,3% (v / v) de Triton X-100. Misture até dissolver completamente.
2. Preparar o tampão de diluição: dissolver 1% de BSA (p/v) em PBS e adicionar 0,3% (v/v) de Triton X-100. Misture até dissolver completamente.
3. Para bloqueio, adicione 200 μL de solução de bloqueio a cada poço. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente ou 16-18 horas a 4 °C.
   nota: Se for usado anticorpo de cabra, adicione soro de cabra a 5% à solução de bloqueio.
4. Dilua o anticorpo primário em tampão de diluição (1:500; consulte a Tabela 1 para obter a lista de anticorpos) e vórtice até ficar bem misturado.
   nota: Se for usado anticorpo de cabra, adicione soro de cabra a 1% ao tampão de diluição.
5. Em uma caixa de umidade/incubação, cole um pedaço de parafilme. Adicione 10 μL de anticorpo primário (em uma única gota). Alinhe uma borda da lamínula com a gota e abaixe lentamente no parafilme, para que o líquido se espalhe por toda parte (evite bolhas, se possível). Incube por 2 horas em temperatura ambiente.
6. Lave as lamínulas três vezes em PBS por 1 minuto.
7. Diluir o anticorpo secundário em tampão de diluição (concentração final: 2 μg/ml) e vórtice até ficar bem misturado.
8. Aplique 10 μL de anticorpo secundário conforme descrito para os anticorpos primários. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente.
   nota: Proteja da luz.

Tabela 1: Anticorpos utilizados. Lista de anticorpos utilizados neste estudo.

anticorpo	companhia	referência	fonte
53BP1	Sinalização Celular	Nº 4937	coelho
IgG H&L anti-rato (Alexa Fluor 647)	Abcam	AB150103	burro
Antifosfo-histona H2A. X (Ser139), clone JBW301	Millipore	Nº 05-636	rato
IgG H&L ANTI-COELHO (Alexa Fluor 488)	Abcam	AB150081	cabra

9. Lave as lamínulas três vezes em PBS por 1 minuto.
10. Lave as lamínulas com H₂O por 1 minuto.
11. Contra-coloração de DNA com DAPI: aplicar 10 μL de DAPI 300 nM (conforme descrito para anticorpos), incubar por 30 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, montar em lâmina de vidro com um meio de montagem à base de glicerol. Como alternativa, adicione uma gota (10 μL) de mídia de montagem antidesbotamento comercial contendo DAPI em uma lâmina e aplique uma lamínula. Pressione suavemente a lamínula e remova o excesso de líquido ao redor dela com uma toalha de papel.
12. Sele as lamínulas com esmalte transparente e deixe secar por 20 minutos.
13. Armazene as lâminas a 4 °C.

3. Aquisição de imagens

1. Coloque uma gota de óleo de imersão na lente objetiva de 60x. Use DAPI para localizar os núcleos através da ocular.
   1. Para aquisição de imagem XYZ, abra o software de aquisição e selecione os parâmetros: Tipo de scanner: Galvano; Modo de scanner: ida e volta; Tamanho da imagem: 512×512; Modo PMT: VBF; Média do PMT: quadro (4 vezes); Varredura sequencial PMT: linha.
   2. Selecione o corante e os detectores:
      Canal (CH1), Corante (DAPI), Detector (SD1)
      Canal (CH2), Corante (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Canal (CH3), Corante (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
   3. Selecione ON em "Z".
2. Ajuste a imagem ao vivo. Pressione o botão Ao vivo na janela Ao vivo.
   1. Ajuste o foco e defina a intensidade do laser (%), sensibilidade (HV), ganho e deslocamento na janela de ferramentas "PMT".
      1. Ajuste a intensidade do laser (%): para brilho e branqueamento. Quanto maior a intensidade do laser, mais forte é o sinal, mas a amostra será fotobranqueada.
      2. Ajuste a sensibilidade (HV): nível de ruído. Quanto maior o HV, mais forte o sinal, mas a imagem será ruidosa se muito alta.
         NOTA: Mantenha sempre a tensão constante.
      3. Ajuste o deslocamento: nível de fundo.
   2. Selecione Início/Fim (15 fatias) para pilhas Z.
3. Inicie a aquisição.
   1. Selecione a pasta para salvar as imagens. Pressione o botão Iniciar do LSM para iniciar a aquisição da imagem. Pressione o botão Série concluída para concluir a aquisição da imagem.

Resultados

Figura 1. Extração nuclear.

Imagens representativas de células antes (esquerda) e pós (direita) extração nuclear. O citoplasma deve ser digerido, mas a estrutura nuclear deve permanecer intacta após a extração (à direita). (A) ampliação de 20x; barra de escala = 20 μm e (B) ampliação de 40x; barra de escala = 10 μm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínula #1, 18 mm redonda (lamínulas)	Neuvitro	NC0308920	As lamínulas precisam ser limpas e esterilizadas antes do uso, com HCl ou etanol.
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190144	PBS para cultura de tecidos
SlowFade Diamond Antifade Mountant com DAPI	Invitrogen	S36973	DAPI de 300 nM com meio de montagem antidesvanecimento VECTASHIELD pode ser usado em seu lugar.
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	Rolamento A3059	Recomenda-se a fração de choque térmico, para evitar precipitação/fundo.
Tritão X-100	Bio Americana	AB02025	Tampão de extração nuclear.
Lâminas de microscópio Superfrost Plus	Marca de pescador	1255015	Slides de polissina podem ser usados em seu lugar.