Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

Resumo

Fonte: Kresoja-Rakic, J., et al. Purificação mediada por afinidade por destiobiotina-estreptavidina de proteínas que interagem com RNA em células de mesotelioma. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Protocolo

1. Preparação da Fração de Proteína Citosólica e Nuclear

1. Placa 4 x 10⁶ células ACC-MESO-4 em frasco de cultura de células T150 cultivado em meio RPMI - 1640 suplementado com 10% de FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100x) e 2 mM de L-Glutamina (200 mM). Quando as células atingirem uma confluência de 80-90% (~ 5-5,5 x 10⁶ células), prossiga com a extração de proteínas das frações nuclear e citosólica.
   nota: A linhagem celular ACC-MESO-4 foi obtida do RIKEN BioResource Centre.
2. Aspire o meio, lave as células adicionando 15 mL de 1x PBS, incline a placa suavemente algumas vezes e aspire o 1x PBS. Adicionar 3 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e incubar o frasco de cultura a 37 °C por 3 min.
   nota: Olhe para as células sob o microscópio para descolamento; Se ainda estiver preso, bata o frasco na palma da mão 3 vezes.
3. Adicione 7 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100x) e 2 mM de L-Glutamina (200 mM), colete as células em um tubo de 15 mL e gire a 200 x g por 5 min.
4. Aspire o meio e ressuspenda o pellet celular com 1,5 mL de 1x PBS e, em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Gire para baixo a 500 x g e 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante.
   nota: A partir desta etapa, execute todas as etapas de centrifugação a 4 °C e mantenha todos os reagentes no gelo.
5. Ressuspenda o pellet celular com 1,5 mL de 1x PBS gelado e gire as células a 500 x g e 4 ° C por 3 min. Descarte o sobrenadante.
   nota: As quantidades necessárias de reagentes CER I, CER II e NER são 10, 0,55 e 5 volumes de volume estimado de pellets celulares, respectivamente; o protocolo a seguir pressupõe um volume de 20 μL. Recomendamos preparar apenas a quantidade necessária de reagente CER I.
6. Adicione 200 μL de reagente de extração citoplasmática gelada (CER I) suplementado com 2 μL de inibidor de proteinase 1x, por exemplo, dilua 1 comprimido de inibidor de protease (sem EDTA) em 500 μL de água para obter 100x o estoque. Essa quantidade de reagente CER I é suficiente para lisar 20 μL de um volume de célula cheio de pellets.
   1. Para estimar o volume embalado de pellets celulares, compare o tubo contendo o pellet celular com um tubo de 1,5 mL preenchido com 10, 20, 50 ou 100 μL de 1x PBS.
7. Ressuspenda o sedimento celular agitando vigorosamente o tubo por 15 s e incube o tubo em gelo por 10 min. Adicione 11 μL de reagente de extração citoplasmática gelada II (CER II) ao tubo, vortex vigorosamente por 5 s e incube por 1 min em gelo.
8. Vortex vigorosamente por 5 s e centrifugue o tubo a 16.000 x g e 4 ° C por 5 min. Transfira o sobrenadante para o tubo limpo pré-resfriado no gelo. O sobrenadante é a fração citoplasmática que é usada posteriormente no experimento de puxada de RNA.
9. Ressuspenda o pellet restante em 100 μL de reagente de extração nuclear gelada (NER) suplementado com 1 μL de inibidor de proteinase (100x) e vore vigorosamente por 15 s. Recomendamos preparar apenas a quantidade necessária de reagente NER suplementado com inibidores de protease.
10. Incubar a amostra em gelo por 40 min com vórtice ocasional por 15 s (a cada 10 min).
11. Centrifugue o tubo a 16.000 x g por 10 min. Transfira o sobrenadante (esta é a fração de proteína nuclear) para um tubo limpo pré-resfriado.
12. Proceda imediatamente medindo a concentração de proteína usando o método bicinchonínico (BCA) (consulte a Tabela de Materiais). Para controlar a pureza protéica de cada fração, realizar immunoblotting (Figura 1) contra α-tubulina (detecção positiva apenas na fração citosólica) e Poli ADP-ribose polimerase - PARP (detecção positiva apenas na fração nuclear).
13. Para manter a atividade proteica e seu estado nativo, prepare 25 μL de alíquotas de extratos citosólicos e nucleares. Congele essas alíquotas colocando-as em nitrogênio líquido por 5 s e armazene diretamente a -80 °C.

2. Marcação de RNA com Desthiobiotin

1. Ter sondas de RNA sintetizadas comercialmente e HPLC purificadas. Ressuspender com água livre de nuclease a 10 μM.
   nota: As sequências de sonda estão listadas na Tabela 1.
2. Use 50 pmol de RNA por reação de puxada de RNA. Descongele e mantenha todos os reagentes no gelo, exceto o PEG 30%, usado para rotular o terminal 3 'do RNA oligo.
3. Transfira 5 μL de sondas de RNA de 10 μM, marcadas como CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) e RNA não relacionado (IRE), para tubos de microcentrífuga de parede fina de 0,5 mL e incube em uma máquina de PCR a 85 °C por 5 min. Coloque os tubos imediatamente no gelo.
   nota: Esta etapa é importante, pois promove o relaxamento e a acessibilidade da sonda de RNA para marcação.
4. Para uma única reação de 30 μL, adicione ao tubo contendo RNA a seguinte mistura de 10 μL: 3 μL de água livre de nuclease, 3 μL de tampão de reação de RNA ligase 10x, 1 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 1 μL de bifosfato de citidina destiobiotinilada (1 mM) e 2 μL de RNA ligase T4 (20 U/μL).
   nota: Para preparar uma mistura mestre A para 3 amostras em excesso (3,2), misture 9,6 μL de água livre de nuclease, 9,6 μL de tampão de reação de RNA ligase 10x, 3,2 μL de inibidor de RNase (40 U / μL), 3,2 μL de bisfosfato de citidina destiobiotinilada (1 mM) e 6,4 μL de T4 RNA ligase (20 U / μL).
5. Adicione cuidadosamente 15 μL de PEG 30% à reação. Use outra dica para misturar a reação. Incubar a reação durante a noite a 16 °C.
6. No dia seguinte, prepare o seguinte: 5 M NaCl (fresco/livre de nuclease), clorofórmio: álcool isoamílico na proporção de 24:1 (por exemplo, por reação - 96 μL de clorofórmio e 4 μL de álcool isoamílico), etanol 100% gelado e etanol 70% gelado.
7. Adicione 70 μL de água livre de nuclease aos tubos de reação de marcação de RNA. Adicione 100 μL de clorofórmio: álcool isoamílico e vórtice brevemente. Rotação a 13.000 x g por 3 min. Remova cuidadosamente APENAS a fase superior e transfira para um novo tubo de 1,5 mL sem nuclease; Evite tocar na fase inferior.
8. Adicione 10 μL de NaCl 5 M, 1 μL de glicogênio e 300 μL de etanol 100% gelado. Colocar o tubo a -20 °C durante 2 h.
   nota: Nesta etapa, o experimento pode ser continuado no dia seguinte.
9. Centrifugar a 13.000 x g e 4 °C durante 15 min. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Adicione 300 μL de etanol a 70% gelado e centrifugue novamente a 13.000 x g e 4 °C por 5 min.
10. Descarte o sobrenadante completamente e seque o pellet ao ar (15 min). Ressuspenda o pellet em 20 μL de água livre de nuclease.
    nota: Prossiga com o pulldown de RNA no mesmo dia.
11. Incubar o RNA a 90 °C durante 2 min e colocá-lo no gelo. Coloque o RNA marcado no gelo durante a etapa seguinte de pré-lavagem das esferas magnéticas de estreptavidina.
    nota: Um tempo de incubação mais longo pode danificar a sonda de RNA.

3. Pulldown de RNA-proteína

1. Pré-lavagem de esferas magnéticas de estreptavidina e incubação com destiobiotina-RNA
   1. Use 50 μL de esferas magnéticas de estreptavidina por 50 pmol de RNA. No entanto, isso deve ser otimizado dependendo do experimento.
   2. Vortex o tubo com esferas magnéticas de estreptavidina por 15 s e remova rapidamente 200 μL (master mix; o suficiente para 3 + 1 reações) em um tubo limpo de 1,5 mL usando pontas de pipeta cortadas. Coloque o tubo em um suporte magnético para que as contas se acumulem na lateral do tubo e aguarde 1 min. Remova o líquido de ressuspensão.
   3. Para lavar as contas, remova o tubo do suporte magnético, adicione 400 μL de solução de NaOH 0,1 M e NaCl 0,05 M e pipete suavemente para cima e para baixo várias vezes. Coloque o tubo de volta no suporte magnético. Aguarde 1 min e colete o sobrenadante. Repita esta etapa novamente.
   4. Lave os grânulos com 200 μL de NaCl 100 mM. Remova o sobrenadante.
   5. Adicione 200 μL de Tris 20 mM (pH 7,5), ressuspenda os grânulos por pipetagem, coloque o tubo no suporte magnético, aguarde 1 min e remova o sobrenadante. Repita a etapa.
   6. Remova o tubo do suporte magnético, adicione 200 μL de tampão de captura de RNA 1x e ressuspenda as esferas magnéticas de estreptavidina por vórtice breve. Remova 50 μL de esferas magnéticas de estreptavidina e adicione a cada tubo de RNA marcado usando uma ponta de pipeta cortada. Incube os tubos por 30 min em temperatura ambiente em um rolo.
2. Ligação da proteína ao RNA
   1. Coloque os tubos em um suporte magnético, aguarde 1 min e remova o sobrenadante.
   2. Adicione 50 μL de Tris 20 mM (pH 7,5) aos grânulos e ressuspenda por pipetagem. Coloque os tubos em um suporte magnético, aguarde 1 min e remova o sobrenadante. Repita esta etapa.
   3. Adicione 100 μL de tampão de ligação 1x proteína-RNA aos grânulos e ressuspenda por pipetagem.
   4. Enquanto isso, prepare a seguinte mistura: 10 μL de tampão de ligação proteína-RNA 10x, 30 μL de glicerol a 50%, 50 μg de proteínas citoplasmáticas e água livre de nuclease até 100 μL.
      nota: Preparar uma mistura principal B para 3 amostras em excesso (3.3) da seguinte forma: 33 μL de tampão de ligação proteína-RNA 10x, 99 μl de glicerol a 50%, 165 μg de proteínas citoplasmáticas e água livre de nuclease até 330 μL. Manter o tubo da mistura principal B no gelo.
   5. Coloque os tubos no suporte magnético, aguarde 1 min e colete o sobrenadante. Adicione 100 μL de master mix B, ressuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo e evite criar bolhas. Incubar tubos de reação por 60 min a 4 °C em um rolo.
3. Lavagem e eluição
   1. Coloque os tubos em um suporte magnético, colete o sobrenadante (que é fluxo através - FT) e transfira-o para um novo tubo.
      nota: Mantenha este FT no gelo para análise posterior.
   2. Pipetar 100 μL de tampão 1x Wash nas contas, ressuspender suavemente, voltar a colocar no suporte magnético, aguardar 1 min e eliminar o sobrenadante. Repita esta etapa 2 vezes.
   3. Adicione 40 μL de tampão de eluição às esferas magnéticas, misture pipetando para cima e para baixo e incube a 37 ° C em um agitador de tubos (950 rpm) por 30 min.
   4. Coloque os tubos em um suporte magnético, aguarde 1 min e colete a amostra eluída (que é eluato - E). Coloque no gelo e use para análise a jusante.
      nota: Nesta etapa, cada sonda de RNA testada consiste em uma amostra de fluxo (FT) e eluato (E).

Resultados

Figura 1: Análise de Western blot de 5 μg de fração de proteína citosólica e nuclear. A proteína PARP está presente na fração nuclear (N), mas ausente na fração citosólica (C). α-tubulina está presente na fração citosólica (C), mas ausente na fração nuclear (N).

Tabela 1: Sequências de sondas de RNA

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NE-PER Kit de extração nuclear e citoplasmática	Thermo Fisher Científico	Nº 78833
Comprimidos inibidores de protease Pierce, sem EDTA	Thermo Fisher Científico	Rolamento A32965
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA	Thermo Fisher Científico	23225
Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce	Thermo Fisher Científico	20164	Inclui esferas magnéticas e, portanto, o kit precisa ser armazenado a 4 °C
Kit de Destiobiotinilação de Ponta de RNA 3' Pierce	Thermo Fisher Científico	20163	O kit faz parte do "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" e precisa ser armazenado a -20 °C, ao contrário do kit pull-down (4 °C).
DynaMag-2, suporte magnético	Thermo Fisher Científico	12321D
RPMI - 1640 médio	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Soro Bovino Filtrado	Pan Biotech	Pág. 40-37500
Penicilina - estreptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	Pág. 4333
Solução de L-Glutamina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% de tripsina-EDTA (1x)	Tecnologias Gibco by Life	Rolamento 25200-056
Solução de descontaminação RNaseZap RNase	Thermo Fisher Científico	AM9780
Síntese de oligo RNA	Mycrosynth AG, Suíça	-	A escala de síntese - 0,04 μmol - purificada por HPLC
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento A7030
Ácido clorídrico (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	Rolamento 182883.1211
Ultra puro 1 m Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Científico	15567027
Glicerol	Thermo Fisher Científico	Rolamento 17904	Alíquotas 50% estéreis para serem armazenadas a -20°C
Perfure as contas magnéticas de estreptavidina	Thermo Fisher Científico	Rolamento 88817	Observe que essas esferas magnéticas têm um diâmetro médio de 1 μm (faixa de 0,5 a 1,5 μm). Além disso, Dynabeads-M280 Streptavidin, que são grânulos de tamanho homogêneo de 2,8 μm, também são usados no pulldown de RNA, mas esteja ciente de que isso pode afetar o processo de purificação.
Alumíniosulfato-(14-18)-hidrato	Sigma-Aldrich	368458
Ácido ortofosfórico	Aplicativo	Rolamento A0637