Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

Resumo

Fonte: Kresoja-Rakic, J., et al. Purificação mediada por afinidade por destiobiotina-estreptavidina de proteínas que interagem com RNA em células de mesotelioma. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Protocolo

1. Preparação da Fração de Proteína Citosólica e Nuclear

1. Placa 4 x 10⁶ células ACC-MESO-4 em frasco de cultura de células T150 cultivado em meio RPMI - 1640 suplementado com 10% de FBS, 1x penicilina/estreptomicina (100x) e 2 mM de L-Glutamina (200 mM). Quando as células atingirem uma confluência de 80-90% (~ 5-5,5 x 10⁶ células), prossiga com a extração de proteínas das frações nuclear e citosólica.
   nota: A linhagem celular ACC-MESO-4 foi obtida do RIKEN BioResource Centre.
2. Aspire o meio, lave as células adicionando 15 mL de 1x PBS, incline a placa suavemente algumas vezes e aspire o....

Resultados

Figura 1: Análise de Western blot de 5 μg de fração de proteína citosólica e nuclear. A proteína PARP está presente na fração nuclear (N), mas ausente na fração citosólica (C). α-tubulina está presente na fração citosólica (C), mas ausente na fração nuclear (N).

Tabela 1: Sequências de sondas de RNA

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NE-PER Kit de extração nuclear e citoplasmática	Thermo Fisher Científico	Nº 78833
Comprimidos inibidores de protease Pierce, sem EDTA	Thermo Fisher Científico	Rolamento A32965
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA	Thermo Fisher Científico	23225
Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce	Thermo Fisher Científico	20164	Inclui esferas magnéticas e, portanto, o kit precisa ser armazenado a 4 °C
Kit de Destiobiotinilação de Ponta de RNA 3' Pierce	Thermo Fisher Científico	20163	O kit faz parte do "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" e precisa ser armazenado a -20 °C, ao contrário do kit pull-down (4 °C).
DynaMag-2, suporte magnético	Thermo Fisher Científico	12321D
RPMI - 1640 médio	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Soro Bovino Filtrado	Pan Biotech	Pág. 40-37500
Penicilina - estreptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	Pág. 4333
Solução de L-Glutamina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% de tripsina-EDTA (1x)	Tecnologias Gibco by Life	Rolamento 25200-056
Solução de descontaminação RNaseZap RNase	Thermo Fisher Científico	AM9780
Síntese de oligo RNA	Mycrosynth AG, Suíça	-	A escala de síntese - 0,04 μmol - purificada por HPLC
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento A7030
Ácido clorídrico (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	Rolamento 182883.1211
Ultra puro 1 m Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Científico	15567027
Glicerol	Thermo Fisher Científico	Rolamento 17904	Alíquotas 50% estéreis para serem armazenadas a -20°C
Perfure as contas magnéticas de estreptavidina	Thermo Fisher Científico	Rolamento 88817	Observe que essas esferas magnéticas têm um diâmetro médio de 1 μm (faixa de 0,5 a 1,5 μm). Além disso, Dynabeads-M280 Streptavidin, que são grânulos de tamanho homogêneo de 2,8 μm, também são usados no pulldown de RNA, mas esteja ciente de que isso pode afetar o processo de purificação.
Alumíniosulfato-(14-18)-hidrato	Sigma-Aldrich	368458
Ácido ortofosfórico	Aplicativo	Rolamento A0637