$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Reação de ligação a proteínas e separação de RNA ligado
- Efectuar a ligação da proteína e do ARN em Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 num volume de 100 μL, adicionando os seguintes ingredientes a estas concentrações finais: KCl 50 mM, DTT 1 mM, albumina sérica bovina 0,09 μg/μL, RNasina 0,5 unidades/μL, tRNA 0,15 μg/μL, EDTA 1 mM, e 30 μL de concentração apropriada de proteína recombinante (PTB). Adicione RNA do pool apropriado.
nota: O fator de splicing U2AF65 normalmente se liga aos locais de splice do trato de polipirimidina / 3 'de íntrons modelo com uma afinidade de ligação (constante de dissociação de equilíbrio ou Kd) de aproximadamente 1–10 nM. Portanto, as duas primeiras rodadas de ligação usaram concentração de proteína 10 vezes acima do Kd para U2AF65; para as proteínas SXL e PTB, a concentração inicial nessa faixa foi apenas nosso melhor palpite. Isso garantiu que as espécies de RNA desejadas pudessem se ligar, embora sequências de afinidade mais baixa também estivessem potencialmente ligadas. Nas rodadas 3 e 4 (transcrição, ligação e amplificação), a concentração de proteína foi reduzida em três vezes. Isso foi feito para eliminar com sucesso as espécies de RNA de baixa afinidade.
- Coloque os tubos contendo as reações de ligação por cerca de 30 min a 25 ° C em um bloco de temperatura (ou no gelo).
- Fracione o RNA ligado do RNA não ligado nas primeiras 4 rodadas de amplificação de seleção usando as etapas a seguir.
- Filtrar a amostra (100 μL) à temperatura ambiente através de um filtro de nitrocelulose acoplado a um coletor de vácuo.
nota: O complexo RNA-proteína, mas não o RNA não ligado, permanece no filtro.
- Pique o filtro com RNA retido em fragmentos com uma lâmina de barbear estéril; insira-os em um tubo de centrífuga. Recupere o RNA girando o tubo suavemente por um mínimo de 3 h (ou durante a noite) com pedaços de filtro imersos no tampão proteinase K (PK).
- Desproteinizar a amostra de RNA por vórtice na presença de um volume igual de fenol-clorofórmio (1:1) e depois de clorofórmio. Recupere a fase aquosa de cada vez, centrifugando a amostra em alta velocidade por 5 min à temperatura ambiente.
- Misture com acetato de sódio (0,1 volume de 3,0 M, pH 5,2) e etanol (2-3 volumes de etanol absoluto, 200 provas). Deixe o tubo em um freezer a -80 ° C por 30 min, centrifugue-o em alta velocidade por 10 min e, seguindo as etapas de lavagem e secagem, solubilize o RNA em água tratada com DEPC.
- Separe as frações de RNA ligadas à proteína das frações não ligadas nas últimas 2 rodadas (rodadas 5 e 6; transcrição, ligação e amplificação) da seguinte forma. Reduzir a concentração de proteínas na reação de ligação (etapa 1.1) em mais três vezes para pressão de seleção adicional para enriquecer as sequências de ligação de alta afinidade e remover preferencialmente as sequências de baixa afinidade.
- Pré-molde um gel de poliacrilamida nativo (5% com proporção de 60:1 acrilamida:bis-acrilamida) em tampão TBE 0,5x (Tris-Borato-EDTA) antes de configurar a reação de ligação de RNA:proteína acima (etapa 1.1). Eletroforese este gel em câmara fria (4 °C) aplicando 250 V por 15 min.
- Pipetar as reações de ligação RNA:proteína acima (etapa 1.1) em diferentes poços deste gel.
nota: A proteína é armazenada a -80 °C e diluída antes do uso em ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (HEPES) 20 mM, pH 8,0, 20% de glicerol, 0,2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,05% NP-40 e 1 mM de ditiotreitol (DTT). A adição de 0,5–1,0 mM inibidor de protease fenilmetano sulfonil fluoreto (PMSF) é opcional. Na reação de ligação, esse tampão contribui com cerca de 6% de glicerol, o que permite o carregamento direto de amostras nos poços sem a necessidade de misturá-las com um tampão de carregamento de gel separado.
- Fracionar o RNA ligado do RNA não ligado usando eletroforese em gel em uma câmara fria (4 ° C) a 250 V por 1 a 2 h. Esse processo também é conhecido como ensaio de deslocamento de mobilidade em gel.
NOTA: A duração da eletroforese varia dependendo das características do RNA e da proteína usada para ligação.
- Exponha o gel a um filme de raios-X e identifique a localização do RNA ligado usando autorradiografia. Corte a fatia de gel com o RNA ligado e insira-a em um tubo.
- Incubar a fatia de gel triturada no tampão PK utilizado para eluição durante 3 h ou durante a noite.
- Vortex a amostra de RNA eluída vigorosamente, primeiro com fenol-clorofórmio e depois com clorofórmio.
- Misturar acetato de sódio e etanol com a fase aquosa após a extracção do clorofórmio. Após a incubação em um freezer a -80 °C, gire a 4 °C por 5 a 10 min para coletar o pellet de RNA. Lave o pellet de RNA com etanol e seque-o ao ar, deixando a tampa do tubo aberta. Dissolva o RNA em água tratada com DEPC.
nota: A mudança para o ensaio de mudança de mobilidade em gel para fracionamento permite a eliminação de espécies indesejadas de RNA que podem ter sido enriquecidas para ligação, por exemplo, ao filtro de nitrocelulose aqui (ou qualquer matriz) usado nas rodadas iniciais para fracionamento.
2. Transcrição reversa e amplificação por PCR
- Sintetize o cDNA a partir do RNA dissolvido usando transcriptase reversa e o primer reverso incubando a reação de 20 μL (2 μL de tampão RT 10x, 2 μL de transcriptase reversa AMV, primer reverso de 1 μM, 10 μL de RNA, inibidor de RNase opcional) a 42 ° C por 60 min.
- Amplifique o cDNA usando 20 a 25 ciclos de PCR. Anexar o promotor da RNA polimerase T7 à biblioteca por reação em cadeia da polimerase (PCR) contendo 1 μM de modelo de biblioteca aleatória de DNA, 1 μM de cada primer, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 μg/μL de albumina de soro bovino acetilada, 2 unidades de Taq polimerase e 200 μM de dNTPs (desoxiguanosina, desoxiadenosina, desoxicitidina e trifosfato de desoxitimidina).
3. Transcrição e ligação a proteínas
- Repita o processo de síntese de RNA, ligação a proteínas e separação de frações ligadas e não ligadas a proteínas.