1. Preparação de materiais
- Prepare solução salina tamponada com fosfato (PBS): 137 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 10 mM de NaH2PO4 e 2 mM de KH2PO4, pH 7.4.
- Prepare o corante NTA-Atto 647 N. Dilua o corante NTA-Atto 647 N em estoque a 100 nM de uma solução 100% DMSO em PBS sem interpolação.
- Expresse Vam7-His8 – Proteína como uma proteína de fusão em E. coli e purifique-a usando Ni-NTA e cromatografia de exclusão de tamanho.
- Titular a substância a analisar em tampão PBS. Se o analito estiver em um tampão diferente, o MST marcado não é particularmente sensível a pequenas diferenças de tampão de moléculas como o DMSO, a menos que o conteúdo do tampão do analito interaja com a proteína marcada.
2. Preparação do dispositivo MST
- Ligue o interruptor de alimentação na parte traseira do dispositivo.
- Abra o software de controle e certifique-se de que o laptop esteja ligado e conectado no computador conectado ao dispositivo.
- Insira as configurações de fluorescência e MST para este experimento. Defina MST Antes para 3 s, MST para 30 s e Recuperação de fluorescência (Fluo.)após 1 s. Antes de medir a fluorescência inicial e não requer longos tempos; MST é a quantidade real de tempo para o equilíbrio ser alcançado após a indução de calor.
- Tabela de capilares: Para cada tubo capilar, insira o nome do alvo (ligante), o nome do ligante (analito), a concentração do alvo e a concentração de titulação mais alta e use a taxa de titulação de preenchimento automático. Por exemplo, insira 50 nM para a concentração alvo de Vam7-His8, Vam7-His8 para o nome alvo, (ácido fosfatídico 1,2-dioctanoílo) Di-C8 PA para o nome do ligante e a concentração mais alta do ligante selecionando 1:1 e arrastando para baixo para os slots de preenchimento automático 2-16.
- Execute um Cap Scan para selecionar o LED apropriado (LED de 20% (predefinido)) com base no sinal da proteína alvo e ajuste entre 200 e 2000 unidades de fluorescência para MST marcado.
- Selecione um intervalo de potências MST e insira valores para cada uma para testar o ajuste de ligação mais robusto e pressione Start Cap Scan + Measurement, digitalizando valores diferentes para determinar as melhores condições operacionais para a interação que está sendo testada.
- Determine a potência do MST com o melhor ajuste usando o software de análise e a predefinição para termoforese com Tjump. Analise os ajustes de acordo com a maioria das separações de fluorescência entre a concentração mais baixa e a mais alta em comparação com a potência MST com o melhor ajuste e selecione a potência MST para ensaios replicados.
- Determine se o fotobranqueamento ocorreu entre a primeira e a segunda execução, acessando o software de análise e alternando a análise para o modo especialista. Em seguida, selecione fluorescência em vez de termoforese para análise. Selecione o modo especialista e, em seguida, o fotobranqueamento.
3. Preparação de amostras para MST marcado
- Levar a solução Vam7-His8 a uma concentração de 200 nM em PBS sem interpolação.
- Traga o corante NTA-Atto 647 para 100 nM em PBS sem interpolação.
- Misture o corante Vam7-His8 e NTA-Atto 647 em uma proporção volumétrica de 1:1 e deixe-o descansar em temperatura ambiente coberto de luz por 30 min. Determine a concentração apropriada de proteína-alvo como na seção 2.5 (consulte o Suplemento sobre a utilização de KD do corante Ni-NTA conforme demonstrado no vídeo).
- Centrifugue a mistura de corante e proteína NTA-Atto 647 N por 10 min em uma sala escura usando uma centrífuga de mesa a aproximadamente 8.161 x g.
- Conservar a mistura a 4 °C após a experiência ou no gelo durante a experiência para reutilização dentro de algumas horas, se necessário, a fim de evitar a desnaturação das proteínas.
- Use o localizador de concentração NT para determinar a faixa de concentração necessária para a titulação.
- Levar Di-C8 PA à concentração máxima adequada em água.
- Titular a substância a analisar utilizando uma diluição seriada de 1:1 em tampão PBS para 16 concentrações, com base no passo anterior. Ao contrário do SPR, a termoforese não é tão sensível às diferenças de buffer.
4. MST de amostras
- Ligue o dispositivo e o laptop conectado.
- Pressione a seta para cima na frente da máquina e deslize a cremalheira capilar para fora.
- Carregue os capilares na estante com a maior concentração na posição 1.
- No software de controle, selecione o Canal Vermelho correspondente a NTA-Atto 647 N.
- Insira informações de concentração, posição e nome para cada capilar na Tabela de capilares.
- Execute uma varredura capilar pressionando Start Cap Scan no LED de 20% (predefinido) e ajuste de acordo entre 200 e 2000 unidades de fluorescência usando as configurações de intensidade do LED ou a concentração do ligante (proteína marcada).
- Selecione um intervalo de potência MST.
- Inicie a varredura da tampa + medição MST.
- Analise usando o software de análise.
