Citometria de fluxo quantitativa para estudar interações proteína-fosfolipídio veicular marcadas

Resumo

Fonte: Podoplelova, N. et al., Analisando a interação de proteínas marcadas com fluorescência com microvesículas fosfolipídicas artificiais usando citometria de fluxo quantitativa. J. Vis. Exp. (2022)

Neste vídeo, demonstramos a interação entre proteínas e vesículas fosfolipídicas artificiais usando citometria de fluxo quantitativa. A ligação de proteínas marcadas com fluorescência a vesículas fosfolipídicas marcadas com fluorescência aumenta a intensidade média de fluorescência, e esse aumento é detectado por um citômetro de fluxo.

Protocolo

1. Detecção da interação proteína-lipídio por citometria de fluxo

1. Experimentos de ligação cinética
   1. Dilua as vesículas fosfolipídicas no tampão de Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM de glicose, 0,5% BSA, pH 7,4) até uma concentração de 1 μM e volume total de 250 μL.
   2. Misture o fator X de coagulação marcado com fluorescência (fX-fd) da etapa 1 a uma concentração de 500 nM com as vesículas fosfolipídicas da etapa 1.1.1 em uma proporção de 1:1 (concentração final da vesícula 0,5 μM, concentração fX-fd é 250 nM de fX) até um volume total de 500 μL.
   3. Injete imediatamente os 500 μL da suspensão mista (~ 20 min para análise com uma baixa taxa de fluxo) no citômetro de fluxo. Use uma taxa de fluxo baixa e certifique-se de que o limite para o canal FL2 (excitação 488 nm, filtro de emissão 585/42 nm) seja o valor 200. Meça a fluorescência média no canal FL4 (excitação 633 nm, filtro de emissão 660/20) para o corante de fluorescência da Tabela de Materiais.
      nota: Escolha um citômetro sem amostrador automático. Isso acelerará o processo de injeção da amostra na célula de medição.
   4. Quando a saturação da ligação for alcançada (sem aumento significativo na fluorescência em 5 min), dilua rapidamente a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode e monitore a dissociação até que a fluorescência da linha de base seja atingida (dissociação completa) ou até que um platô seja atingido (sem diminuição significativa na fluorescência em 5 min).
      nota: Como controle, adicione 10 μM de EDTA e monitore a dissociação completa por 5 min.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Éster Alexa Fluor 647 NHS (éster succinimidílico)	Thermo Fisher Científico	Rolamento A37573	Corante fluorescente
BD FACSCantoII	BD Biociência
DiIC16(3) (perclorato de 1,1'-dihexadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina)	Thermo Fisher Científico	D384	Corante fluorescente
Dmso	Sigma Aldrich	D8418
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-fosfatidilserina (Cérebro, Suíno) (sal de sódio)	Lipídios Polares Avanti	840032P
L-α-fosfatidilcolina (Cérebro, Suíno)	Lipídios Polares Avanti	840053P
Mini-Extrusora	Lipídios Polares Avanti	610020-1EA
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	Rolamento P9541-500G
Cloreto de cálcio anidro, em pó, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Fosfato de sódio monobásico	Sigma Aldrich	S3139-250G
cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S3014-500G
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	M8266-100G
Albumina de soro bovino	Ciências da vida da VWR AMRESCO	Am-O332-0.1
Sal dissódico EDTA	Ciências da vida da VWR AMRESCO	Am-O105B-0.1