NOTA: Os tampões devem ser filtrados usando um filtro de 0.22 μm e desgaseificados por vácuo por 1 h.
1. Preparação de Vesícula Lipídica
- Use tubos de vidro de 2 mL. Dissolva cada lipídio, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS) e colesterol (Chol), em uma mistura de clorofórmio / metanol (50:50 v / v) para preparar uma solução lipídica límpida de 5 mM. Dissolver o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol-4',5'-bifosfato) [PI(4,5)P2] numa mistura de clorofórmio/metanol/água (20:9:1 v/v).
- Combine os lipídios dissolvidos na proporção molar desejada de POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) e POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabela 1) em tubos de vidro de 10 mL.
nota: A quantidade final de lipídios totais é de 500 μg.
- Evaporar os solventes orgânicos utilizando uma corrente seca de azoto. Deixe a mistura lipídica em um sistema de alto vácuo (liofilização) por 3 h para remover quaisquer vestígios residuais dos solventes.
nota: Isso resulta em um filme claro e seco.
- Ressuspenda o filme lipídico em 1 mL de tampão citrato (10 mM de citrato de trissódio, 150 mM de NaCl, pH 4,6). Incubar a suspensão lipídica a 60 °C (esta temperatura é cerca de 10 °C acima da temperatura de transição de fase do lípido de maior fusão na mistura) durante 30 min em banho-maria e vórtice vigorosamente a cada 5 min.
nota: Isso resulta na formação de grandes vesículas multilamelares (MLVs). Mantenha a suspensão acima da temperatura de transição.
- Pré-aqueça a extrusora (a 60 °C neste caso) equipada com uma membrana de policarbonato do tamanho de poros de 50 nm de diâmetro acima da temperatura de transição (que é de 40 - 50 °C aqui) por 30 min.
- Carregue a suspensão MLV na extrusora pré-aquecida e passe suavemente a mistura 31x através da membrana de policarbonato para formar pequenas vesículas unilamelares (SUVs). Mantenha a temperatura acima da temperatura de transição.
- Transfira a suspensão do SUV para um recipiente de reação de plástico de 2 mL e adicione o tampão de citrato (consulte a etapa 1.4) para trazer o volume final para 2 mL.
nota: Isso produzirá uma concentração lipídica final de 250 μg / mL.
2. Manuseio dos sensores de quartzo
NOTA: Sempre manuseie os sensores de quartzo com uma pinça.
- Incube quatro sensores inseridos em um suporte de politetrafluoretileno em uma solução de SDS a 2% por ≥ 30 min. Lave-os extensivamente com água ultrapura para remover completamente o SDS e deixe-os secar usando um jato de argônio ou nitrogênio seco.
- Use um sistema de limpeza de plasma para remover completamente quaisquer contaminantes. Insira os sensores secos na câmara de limpeza de plasma, evacue a câmara e lave-a 3x com oxigênio. Ligue o limpador de plasma. Use os seguintes parâmetros de processo: 1 x 10-4 Torr de pressão, alta potência de radiofrequência (RF) e 10 min de tempo de processo. Desligue a máquina e retire os sensores.
3. Operação de microbalança
NOTA: Foi utilizado um sistema de microbalança com quatro câmaras de fluxo com temperatura controlada em configuração paralela, conectadas a uma bomba peristáltica e ajustadas para uma vazão de 80 μL/min. No modo de fluxo aberto, o tampão foi bombeado do reservatório alimentador para o tanque receptor. No modo loop, o tanque receptor foi conectado ao reservatório do alimentador para gerar um loop fechado. A temperatura foi regulada para 20 °C.
- Encaixe cuidadosamente os sensores limpos de plasma nas 4 câmaras de fluxo, usando uma pinça. Evite qualquer pressão ou torção nas câmaras e nos tubos que possam causar vazamentos.
- Lave o sistema com tampão citrato (10 mM de citrato de trisódio, 150 mM de NaCl, pH 4,6) no modo de fluxo aberto por 10 min.
nota: Isso requer exatamente 3,2 mL de tampão, mas é aconselhável usar um excesso de tampão (10 mL).
- Inicie o programa. Comece a gravar quaisquer alterações na frequência e dissipação do primeiro tom fundamental (n = 1º) e harmônicos (n = 3º - 13º) usando o software, até que as linhas de base de frequência e dissipação estejam estáveis (isso levará cerca de 40 a 60 min).
nota: Os níveis de ruído de frequência (pico a pico) devem ser inferiores a 0,5 Hz e, para a dissipação, inferiores a 0,1,10-6, com um desvio máximo (em solução aquosa) de 1 Hz/h na frequência e 0,3,10-6/h na dissipação.
- Quando as linhas de base estiverem estáveis, aplique a suspensão SUV em tampão citrato (2 mL em um tubo pequeno). Usando um recipiente de reação, remova 1,5 mL do volume morto. Em seguida, feche o sistema no modo de fluxo de loop. Registre a mudança de frequência/dissipação por mais 10 minutos.
nota: Durante esse tempo, as vesículas se espalharão na superfície do SiO2 e se fundirão para formar uma bicamada contínua (etapa 2 nas Figuras 1, Figura 2 e Figura 3). A adsorção dos SUVs na superfície do sensor é bifásica e tem uma frequência típica mínima e máxima na dissipação. Uma nova linha de base de frequência/dissipação estável com uma mudança de frequência característica (dependendo da composição lipídica) de 26 a 29 Hz (ver Tabela 1) indica uma bicamada contínua na superfície.
- Quando o SLB estiver estável (consulte a etapa 3.4), equilibre o sistema com o tampão de corrida (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) nas concentrações necessárias de Ca2+ (variando de 50 μM até 1 mM CaCl2, dependendo do experimento) em um modo de fluxo aberto por 40 min.
- Adicione a proteína (aqui, AnxA2) ao tampão de corrida contendo Ca2+ (consulte o passo 3.5). Execute a aplicação da proteína em um modo de fluxo em loop até que um estado estacionário de equilíbrio seja alcançado (etapa 3 na Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
nota: A concentração de proteína pode variar de 1 a 400 nM. A adsorção de proteínas resulta em uma mudança de frequência dependente da concentração refletindo a adsorção de massa (proteína).
- Dissociar a proteína ligada quelando íons Ca2+ com 5 mM EGTA no tampão de corrida no modo de fluxo aberto (etapa 4 nas Figuras 1 e Figura 2).
nota: Uma recuperação da frequência e dissipação para a linha de base da BLS indica reversibilidade total da ligação às proteínas. Os ciclos de associação-dissociação podem ser repetidos para comparar diferentes concentrações ou proteínas.
