$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Imagem da formação de condensação EWS-FLI1 em cortinas de DNA
- Abra o software de imagem, encontre e marque as posições dos 3 × 3 padrões em zigue-zague sob o campo claro.
- Ligue o fluxo a 0,2 mL/min para corar o DNA com o corante de DNA de fita dupla por 10 min.
- Diluir mCherry-EWS-FLI1 com o tampão de imagem até a concentração de 100 nM em 100 μL no tubo.
- Carregue a proteína sample através da válvula com uma seringa de vidro de 100 μL e altere a taxa de fluxo para 0,4 mL / min.
- Ligue o laser de 488 nm e faça uma pré-varredura de cada região para verificar o estado de distribuição do DNA; selecione a região onde as moléculas de DNA se distribuem uniformemente. Defina a potência do laser para 10% para o laser de 488 nm e 20% para o laser de 561 nm. Use o medidor de potência para medir a potência real do laser perto do prisma: 4,5 mW para o laser de 488 nm e 16,0 mW para o laser de 561 nm.
- Aquisição de imagem
- Comece a adquirir imagens em intervalos de 2 s com lasers de 488 nm e 561 nm simultaneamente.
- Mude a válvula do modo manual para o modo de injeção para permitir que o tampão de imagem libere a proteína sample na célula de fluxo após 60 s.
nota: Este processo levará ~ 30 s, e o campo de visão será coberto com sinais mCherry assim que as proteínas EWS-FLI1 atingirem a célula de fluxo.
- Para remover o EWS-FLI1 livre, continue lavando a célula de fluxo com o tampão de imagem por 5 minutos apenas com o laser de 561 nm ligado. Pare o fluxo e incube a 37 °C por 10 min.
- Ligue o fluxo a 0,4 mL/min para permitir que o DNA se estenda e adquira imagens em intervalos de 2 s entre diferentes quadros para obter dados de alto rendimento da formação de condensado EWS-FLI1.
2. Análise de intensidade para mCherry-EWS-FLI1
- Importe os dados como sequências de imagens para o software ImageJ, escolha os pontos em 25× sites GGAA em um quadrado de 8×8 pixels e salve a imagem em .tif formato.
- Calcule a intensidade como a soma da intensidade no quadrado de 8×8 pixels, incluindo todo o ponto, e remova o plano de fundo subtraindo a intensidade do plano de fundo em uma área do mesmo tamanho perto do quadrado de 8x8 pixels.