Artigo de método

Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: Um estudo sem rótulo das interações proteína-fosfoinositídeo. J. Vis. Exp. (2017)

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.

Protocolo

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1. Formando Bicamadas Lipídicas Suportadas (SLBs)

  1. Transfira 100 μL de SUVs contendo PI (4,5) P2 para um tubo de microcentrífuga de 0,65 mL. Ajuste o pH da solução para ~3,2 adicionando 6,4 μL de ácido clorídrico 0,2 N.
    nota: Confirme o pH da solução com um medidor de pH equipado com uma micro sonda de pH (consulte a tabela de materiais).
  2. Pipetar 10 μL da solução SUV com pH ajustado em cada canal através da entrada e aplicar pressão através da pipeta até que a solução atinja a saída. Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo.
  3. Repita a etapa acima para cada canal e, em seguida, incube o dispositivo por 10 min em RT.
    nota: A injeção de vesículas em microcanais deve ser realizada imediatamente após a montagem do dispositivo.
  4. Corte os conjuntos de tubos de entrada e saída cada um com 60 cm (tubo de entrada) e 8 cm (tubo de saída) de comprimento, respectivamente.
    nota: Cortar a tubulação na diagonal e criar uma borda afiada facilita a inserção da tubulação nas entradas e saídas. A tubulação de saída deve ter uma forma de arco. O comprimento da tubulação de entrada pode variar de acordo com a configuração do microscópio. O diâmetro interno da tubulação é de 0,05 cm.
  5. Usando uma pinça, conecte o conjunto de tubos de saída ao dispositivo e, em seguida, prenda o dispositivo em um microscópio stage.
  6. Mergulhe uma extremidade do conjunto de tubos de entrada em 25 mL de tampão de corrida contido em um tubo cônico e prenda-o com fita adesiva para certificar-se de que o tubo esteja preso.
  7. Coloque o tubo cônico em um terreno mais alto (~ 20 cm) do que o dispositivo para empurrar a solução através dos microcanais por fluxo de gravidade; um macaco de laboratório pode ser usado para conseguir isso.
  8. Para cada tubo de entrada, use uma seringa para extrair 1 mL de tampão de corrida da extremidade livre do tubo. Remova a ponta da pipeta da entrada e insira a extremidade livre do tubo de entrada no dispositivo.
    nota: Introduza uma gota de buffer de corrida na entrada para reduzir a probabilidade de uma bolha de ar ser introduzida no canal durante esta etapa. Depois que a tubulação de entrada estiver conectada ao dispositivo, use um pano sem fiapos para remover o excesso de buffer.
  9. Repita a etapa acima para conectar todas as peças da tubulação de entrada ao dispositivo.
    nota: O fluxo do buffer de corrida através dos canais ajuda a remover o excesso de vesículas e equilibrar a bicamada em condições experimentais.
  10. Abra o software de controle do microscópio (consulte a tabela de materiais). No painel esquerdo, clique na guia "Microscópio" e escolha a objetiva "10X".
  11. Clique nos ícones de imagem "Ao vivo" e depois em "Alexa 568" na barra de ferramentas. Usando os botões de ajuste fino e de curso, concentre-se nos microcanais.
  12. Examine o dispositivo para verificar a qualidade dos SLBs e dos canais (Figura 1). Em seguida, clique no ícone de imagem "FL Shutter Closed" na barra de ferramentas.
  13. Clique na guia "Aquisição" e, em "Ajustes básicos", selecione "Tempo de exposição". Defina o tempo de exposição para "200 ms".
  14. No painel esquerdo, clique em "Multidimensional Acquisition" e no menu de filtros selecione o canal vermelho (marcado como "Alexa 568"). Em seguida, clique no menu "lapso de tempo", defina o intervalo de tempo para 5 min, duração para 30 min e clique em "Iniciar".
    nota: Com base na duração (30 min) e na taxa de fluxo (~1,0 μL/min), 30 μL de buffer de corrida são usados para equilibrar o SLB dentro de um canal, ou seja, 240 μL de buffer de corrida são usados para todos os 8 canais.
  15. Selecione a ferramenta "Círculo" na guia "Medir" e desenhe um círculo em qualquer canal. Clique com o botão direito enquanto o círculo está selecionado e escolha "Propriedades". Na guia "Perfil", marque "todos os T" para visualizar a intensidade da fluorescência em função do tempo.
    1. Certifique-se de que essa curva atinja um platô, que indica equilíbrio, antes de prosseguir para a próxima etapa.
  16. Abaixe a solução tampão para um aterramento igual ao do dispositivo para interromper o fluxo.
  17. Salve o arquivo de lapso de tempo.

2. Testando a interação do domínio PLC-δ1 PH com SLBs contendo PI(4,5)P2

  1. Prepare diluições do domínio PH usando o buffer de execução como diluente.
    nota: Como há oito canais dentro do dispositivo, use pelo menos dois deles para controles em branco. Escolha as extremidades de cada lado e use os canais restantes para diluições de proteínas. As seguintes concentrações do domínio PH foram testadas: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 e 2,50 μM. Aproximadamente 200 μL de cada diluição foram suficientes para atingir o equilíbrio em 30 min.
  2. Um de cada vez, retire cada tubo de saída e aplique 200 μL de cada diluição de proteína no canal de saída usando uma pipeta. Não aplique nenhuma pressão, deixe a gravidade fazer o trabalho. Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo microfluídico.
  3. Repita a etapa acima para cada canal e certifique-se de que bolhas de ar não sejam introduzidas nos canais durante esse processo.
  4. Abaixe a tubulação de entrada para um solo abaixo do dispositivo microfluídico para começar a fluir a proteína através dos microcanais. Cole a extremidade livre do tubo em um recipiente de resíduos. Fluxo das diluições de proteínas por 30 min.
    nota: Isso reverterá o fluxo e permitirá que a proteína seja introduzida nos canais. O tempo de equilíbrio e o volume de diluições de proteínas necessárias dependerão da afinidade da interação.
  5. No painel esquerdo do software, na guia "Time Lapse", clique em "Iniciar" para iniciar a imagem novamente.
  6. Quando o experimento for concluído, salve o arquivo de lapso de tempo.

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Resultados

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figure-results-1
Figura 1: Avaliação da integridade de SLBs e microcanais. (A) Uma imagem ilustrando SLBs e microcanais de alta qualidade. (B) Fusão incompleta. (C) Microcanais fundidos. (D) Partícula de poeira presa dentro de um microcanal. (E) Bolhas de ar presas dentro de microcanais.

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolinaLipídios Polares Avanti850457CPOPC
L-α-fosfatidilinositol-4-fosfatoLipídios Polares Avanti840045XPI4P
L-α-fosfatidilinositol-4,5-bifosfatoLipídios Polares Avanti840046XPI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminaLipídios Polares Avanti850757Cpapa; Necessário para a síntese de oSRB-POPE
Cloreto de lissamina rodamina B sulfonilo (isómeros mistos)ThermoFisher ScientificL-20Necessário para a síntese de oSRB-POPE
Sonda lipídica fluorescente sensível ao pH (oSRB-POPE)InternamenteN/ASíntese interna (Huang D. et al. 2013)
Microscópio de epifluorescência Axiovert 200MMicroscopia Carl ZeissN/Amicroscópio
Câmera AxioCam MRmMicroscopia Carl ZeissN/Acâmera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/Aluz
Conjunto de filtros Alexa 568Microscopia Carl ZeissN/AEx/Em 576/603 nm
Software AxioVision LE64 v.4.9.1.0Microscopia Carl ZeissN/ASoftware de processamento de imagem
DicasVWR10034-132Ponteiras de pipeta de 200 uL; Ponta fina e lisa para aplicar a solução proteica no canal microfluídico
DicasVWRRolamento 53509-070Ponteiras de pipeta de 10 uL; Ponta fina e lisa para aplicar a solução de vesícula no canal microfluídico
Medidor de pH Orion Star A321Thermo CientíficoSTARA3210Medidor de pH
Micro sonda de pH OrionThermo Científico8220BNWPmicro sonda de pH
N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico)VWRVWRB30487HEPES, Ácido Livre
cloreto de sódioVWRBDH8014-2.5KGRNaCl
tubulaçãoAllied Wire & CableTFT-200-24 NDiâmetro interno: 0,020-0,026 polegadas (0,051-0,066 cm); Espessura da parede: 0,010 polegadas (0,025 cm); Tubulação flexível de parede fina de politetrafluoretileno; Cor natural
Gás nitrogênio - IndustrialPraxairN/AProvedor local
Gás oxigênio - IndustrialPraxairN/AProvedor local
Nitrogênio líquidoPraxairN/AProvedor local

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