1. Configuração de reagentes e soluções
- Para preparar o DMEM completo, adicione 5 mL de L-glutamina 200 mM, 5 mL de penicilina-estreptomicina 100x e 50 mL de soro fetal bovino (FBS, concentração final de 10% vol/vol) a 440 mL de DMEM.
nota: Esta solução pode ser conservada a 4 °C durante 1 mês.
- Prepare a solução de agarose dissolvendo 150 mg de agarose com baixo teor de gelificação em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 85 ° C para obter uma solução a 1,5% (p / v). Esterilizar por filtração com um filtro de 0,22 μm. Prepare alíquotas de 1 mL de solução de agarose em 1,5 N
- Prepare o meio do biorreator.
- Dissolver 13,4 g de pó de DMEM em 1 L de H2O. ultrapuro
nota: Dependendo da aplicação, o volume final necessário pode diferir (por exemplo, para 500 mL de meio, dissolva 6,7 g de pó em 500 mL H2O).
- Adicione 2% de FBS, 10 mM de NaHCO3, 1x penicilina-estreptomicina (100x) e 2% de D2O (por exemplo, para 500 mL de meio, adicione 10 mL de FBS, 0,4 g de NaHCO3, 5 mL de penicilina-estreptomicina 100x e 10 mL de D2O).
- Meça o pH usando um medidor de pH e, se necessário, ajuste para 7,4 adicionando HCl.
nota: Normalmente, o pH inicial é muito próximo de 7,4.
- Filtre o meio do biorreator com um filtro estéril acionado a vácuo em um frasco de vidro estéril de 250 mL ou 500 mL.
- Na capela de fluxo laminar, sele o frasco com um capacete de aço estéril com dois bicos de mangueira e conecte-os a um tubo FEP (diâmetro externo = 1/8", diâmetro interno = 1,6 mm) que será conectado à bomba e a um filtro de seringa de PTFE de 0,22 μm para entrada de ar.
2. Configuração do biorreator
- Monte a unidade de fluxo usando um segundo tubo de RMN da unidade de fluxo, que será posteriormente substituído pelo que contém as células. Consulte as instruções de operação da unidade de fluxo para a montagem correta.
nota: Neste ponto, a unidade de fluxo já deve estar limpa (caso contrário, execute a etapa 4.2).
- Ajuste o banho-maria conectado ao controle de temperatura da unidade de fluxo para 37 °C. Coloque a garrafa reservatório no banho-maria.
- Conecte a tubulação FEP da garrafa reservatório à bomba.
- Gire a válvula do biorreator para "bypass" e pré-encha a bomba com um meio.
- Gire a válvula do biorreator para "fluxo" e pré-encha o biorreator com o meio a 0.1 mL/min.
3. Preparação da amostra de células
- Colete as células da incubadora de CO2.
- Pegue um frasco T75 de células HEK293T transfectadas da incubadora de CO2 e remova o meio gasto.
- Lave as células duas vezes com 7 mL (cada) de PBS à temperatura ambiente (~ 20 ° C).
- Use 2 mL de tripsina / EDTA para separar as células. Após adicionar a solução, incubar por 5 min em temperatura ambiente para separar as células.
nota: As células transfectadas podem demorar um pouco mais para se desprender. Se necessário, incubar as células a 37 °C.
- Inative a tripsina com 20 mL de DMEM completo; ressuspenda completamente as células pipetando para cima e para baixo e transferindo-as em um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugue as células a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
- Lave as células com 10 mL de PBS à temperatura ambiente para remover o meio residual.
- Centrifugue as células a 800 x g por 5 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
- Transfira o pellet celular para um tubo de microcentrífuga com tampa de 1,5 mL.
- Incorpore células em fios de agarose.
- Derreter uma alíquota de agarose solidificada a 85 °C em banho-maria e, em seguida, mantê-la em solução a 37 °C num aquecedor de blocos.
- Com uma pipeta Pasteur, encha o fundo do tubo de RMN da unidade de fluxo com 60-70 μL de gel de agarose a 1,5% e coloque-o no gelo. Isso criará um plugue inferior de ~ 5 mm de altura que permite colocar a amostra da célula dentro do volume ativo da bobina de RMN de 1H.
- Aquecer o sedimento de células obtido no passo 3.1.8 a 37 °C durante 15−20 s no termobloco.
- Ressuspenda as células em 450 μL de solução de agarose. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas.
- Aspire a suspensão de agarose celular em um tubo PEEK de cromatografia de ~ 30 cm de comprimento (id = 0,75 mm) conectado a uma seringa de 1 mL.
nota: Antes da aspiração, o tubo e o volume morto da seringa devem ser pré-preenchidos com PBS à temperatura ambiente para evitar a formação de bolhas. O comprimento da tubulação não é crítico.
- Deixe a tubulação esfriar em temperatura ambiente por 2 min.
- Pré-encha o tubo NMR da unidade de fluxo com 100 μL de PBS à temperatura ambiente.
- Funda fios de células embebidas em agarose no tubo de RMN da unidade de fluxo empurrando suavemente a seringa.
nota: Para encher o tubo de RMN de forma homogênea, comece colocando a extremidade do tubo PEEK na parte inferior do tubo de RMN e prossiga em direção ao topo enquanto balança lentamente da esquerda para a direita.
- Repita as etapas 3.2.5, 3.2.6 e 3.2.8 até que toda a suspensão de agarose celular tenha sido moldada.
- Insira as células no biorreator.
- Remova o tubo de RMN vazio da unidade de fluxo e aumente a taxa de fluxo para 2 mL/min por alguns minutos para remover bolhas de gás residuais na tubulação de entrada.
- Defina a taxa de fluxo para 0,2 mL/min e insira o tubo de RMN contendo as células, empurrando-o para cima lenta mas firmemente.
nota: O fluxo ativo do meio evita o refluxo do conteúdo do tubo através da entrada que, de outra forma, ocorreria durante a inserção.
4. Operação e limpeza do biorreator
- Operação do biorreator durante o experimento de RMN.
- Defina a temperatura no espectrômetro de RMN para 310 K.
- Inserir a unidade de fluxo no espectrómetro.
- Forneça o meio do biorreator a uma taxa de fluxo de 0,1 mL / min durante toda a duração dos experimentos de RMN na célula.
- No momento desejado durante o experimento, injetar uma solução concentrada da molécula externa no frasco reservatório médio, perfurando o tubo de silicone com uma seringa estéril de agulha longa.
nota: A concentração final da molécula no meio deve ser escolhida com base no conhecimento prévio da toxicidade celular e, se disponível, na taxa de difusão prevista/estimada através da membrana celular.
- No final do experimento de RMN, substitua o tubo que contém as células por um tubo vazio e lave a unidade de fluxo com água.
- Biorreator limpo no local.
- Limpe a unidade de fluxo fluindo as seguintes soluções a 1 mL / min: hidróxido de sódio (NaOH) 0,2 M; ácido cítrico 3 M; NaOH 0,2 M, por pelo menos 30 min cada, seguido de água ultrapura filtrada estéril por >2 h.
- Limpe e autoclave a garrafa do reservatório e o conjunto da tubulação após cada execução.
5. Experimentos de RMN
- Configuração dos experimentos de RMN.
nota: Execute essas etapas com antecedência, antes da preparação da amostra de RMN na célula, para evitar atrasos entre a coleta da célula e a aquisição de dados.
- Crie um novo conjunto de dados no espectrômetro de RMN e defina os parâmetros para os experimentos de RMN desejados.
- Defina parâmetros para experimentos de RMN 1D 1H.
- Centralize a frequência portadora de 1H em 4.7 ppm no sinal de água.
- Selecione o programa de pulso zgesgp, defina a largura espectral para 20 ppm e um pulso quadrado de 1.000 μs e 180° para supressão de água. Defina um atraso entre varreduras de 1 s. Adquira o espectro com 32 varreduras.
- Para células que expressam CA II não marcado: selecione o programa de pulso p3919gp, defina a largura espectral para 30 ppm para cobrir a região imino do espectro e ajuste o atraso para supressão de água binomial de modo que a excitação máxima seja centrada nos deslocamentos químicos dos sinais de interesse (d7 = 20 μs a 950 MHz). Defina um atraso entre varreduras de ≥1 s. Adquira com 512 varreduras.
- Para células que expressam 15SOD1 marcado com N: selecione o programa de pulso sfhmqf3gpph, defina as larguras espectrais de 1H e 15N para 16 e 50 ppm, respectivamente, o deslocamento de pulso moldado e a largura de banda de excitação para 8.5 e 6 ppm, respectivamente, e um pulso de 350 μs para esquema de desacoplamento (garp4 ou outro, dependendo do instrumento). Defina um atraso entre varreduras de 0.3 s. Adquira 16 varreduras e 128 incrementos na dimensão de 15N.
- Aquisição de espectros de RMN em tempo real.
- Uma vez inserido o biorreator no espectrômetro de RMN, aguarde alguns minutos para permitir a troca do meio.
nota: Este processo é facilmente monitorado a partir da aparência do sinal de bloqueio, pois o PBS é substituído por um meio contendo 2% D2O.
- Ajuste a correspondência e a sintonia do canal 1H, calce o ímã e calcule o comprimento do pulso forte de 1H 90°.
- Ajuste os níveis de potência de 1H em cada sequência de pulso de acordo com o pulso forte de 1H.
- Registar um primeiro espectro zgesgp 1H para verificar o conteúdo da amostra e a homogeneidade do campo.
- Copie os experimentos zgesgp e p3919gp/sfhmqcf3gpph para o número desejado e enfileire-os no spooler de aquisição.
Ca: Os espectros zgesgp são usados apenas para controlar o estado da amostra e a homogeneidade do campo; portanto, eles podem ser ignorados ou gravados com menos frequência.
- Para células que expressam CA II não marcado: processe os espectros p3919gp aplicando preenchimento zero e função de janela de alargamento de linha exponencial (LB = 20 Hz).
- Para células que expressam 15SOD1 marcada com N: processe os espectros sfhmqcf3gpph aplicando preenchimento zero e função de janela de sino quadrada (SSB = 2) em ambas as dimensões.
nota: O tamanho dos espectros processados pode ser reduzido ainda mais removendo regiões livres de sinais (no Topspin, isso é feito definindo os valores STSR e STSI desejados).
