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NOTA: A seguir estão as etapas para rastrear fagos T7 que reconhecem drogas usando um biossensor QCM e recuperar os fagos rastreados por meio de infecção por E. coli (BLT5615). Os protocolos para a síntese de um derivado de uma pequena molécula que forma uma monocamada auto-montada (SAM) e para a construção da biblioteca de peptídeos aleatórios de 15 meros exibidos por fagos T7 podem ser encontrados em outros lugares.
1. Preparação do chip sensor QCM
- Conecte um chip sensor de cerâmica no oscilador de um aparelho QCM de 27 MHz e registre a frequência intrínseca (Hz) na fase aérea antes da imobilização de pequenas moléculas.
- Separar o chip e soltar 20 μL de uma solução (1 mM em etanol a 70%) de um derivado de molécula pequena que forma SAM no eletrodo de ouro do chip sensor usando uma pipeta.
cuidado: O cristal do chip sensor onde o eletrodo de ouro (Au, 0,1 mm de espessura, 2,5 mm de diâmetro interno, 4,9 mm2) está localizado é extremamente fino e pode rachar facilmente (SiO2, 0,06 mm de espessura, 9 mm de diâmetro interno). Portanto, pipete com cuidado.
- Deixar repousar durante 1 h à temperatura ambiente (cerca de 20 °C) numa placa de Petri com tecido humedecido e protegida das luzes ambientes.
- Lave a superfície do eletrodo suavemente com água ultrapura; em seguida, remova as gotas de água soprando ar com uma seringa ou espanador de ar.
- Configure o chip sensor para o aparelho QCM e registre a redução da frequência na fase aérea para medir a quantidade da pequena molécula que foi imobilizada.
nota: Pelo menos, 100 Hz de frequência intrínseca são necessários para uma imobilização bem-sucedida de pequenas moléculas (1 Hz imobiliza 30 pg).
2. Biopanning da biblioteca de fagos T7 usando um biossensor QCM (Figura 1)
- Coloque uma cubeta com um agitador magnético dedicado no biossensor QCM e despeje 8 mL do tampão de reação (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) na cubeta.
- Conecte o chip do sensor QCM ao oscilador e puxe para baixo o braço do oscilador para mergulhar o chip no buffer que está sendo agitado a 1000 rpm.
- Comece a monitorar a frequência do QCM no computador pessoal (PC) e aguarde até que o sensorgrama se equilibre em cerca de 3 Hz/min do desvio de frequência.
- Injete 8 μL de uma biblioteca de fagos T7 (1-2 × 1010 pfu / mL) na cubeta (concentração final: 1-2 × 107 pfu / mL) e marque o ponto de injeção no sensor.
- Monitore a redução de frequência causada pela ligação dos fagos T7 à pequena molécula imobilizada na superfície do eletrodo de ouro por 10 min.
- Pare o monitor de frequência QCM, desaloje o chip do sensor do oscilador e remova o buffer soprando ar e/ou absorvendo com lenços.
- Coloque o chip do sensor em uma placa de Petri úmida e solte os 20 μL da suspensão de E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 após agitar a 37 ° C adicionando IPTG a 1 mM) células hospedeiras na fase logarítmica no eletrodo de ouro.
- Feche a tampa do prato e cubra-o com papel alumínio para bloquear a luz.
- Incubar a placa a 37 °C durante 30 min num misturador de microplacas de 96 poços (1000-1500 rpm) para melhorar a recuperação dos fagos T7 ligados.
- Recupere os 20 μL da solução e suspenda-os em 200 μL de meio LB.
nota: As amostras obtidas nesta etapa podem ser conservadas a 4 °C durante uma semana.
- Preparar uma série de diluições da solução de fago para isolamento da placa e sequenciação do ADN de acordo com o procedimento geral descrito nas instruções do fabricante.
