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1. Preparação do sistema
- Conecte os detectores MALS e dRI a jusante do detector UV do FPLC. Ignore os detectores de pH e condutividade, pois eles adicionarão um volume significativo entre os detectores UV e MALS. Use tubos capilares de 0,25 mm de diâmetro interno da coluna para e entre os detectores e tubos capilares de 0,75 mm de diâmetro interno na saída dos detectores para o coletor de resíduos ou frações.
- Certifique-se de que as conexões de sinal necessárias entre o FPLC e os detectores tenham sido estabelecidas, incluindo saída analógica do detector de UV para a entrada analógica MALS e saída digital do FPLC para a injeção automática MALS, por meio da caixa de E/S do FPLC.
- Instale uma coluna SEC analítica adequada cobrindo uma faixa de fracionamento de pelo menos 20 kDa a 500 kDa. Verifique as informações do produto para determinar se a coluna é adequada para a faixa de MW, pH e outras propriedades da amostra e da fase móvel.
2. Preparação do buffer, lavagem do sistema durante a noite e verificação da limpeza
- Usando reagentes de grau HPLC, prepare 1 L de solução salina tamponada com fosfato com 50-100 mM de NaCl. Filtrar o tampão a 0,1 μm utilizando um filtro de poliéter-sulfona ou similar. Filtre os primeiros 50-100 mL de tampão para um frasco de resíduos e descarte, a fim de eliminar partículas dos filtros secos e, em seguida, filtre o restante para um frasco limpo e estéril que tenha sido cuidadosamente lavado com água filtrada e desionizada e tampado para evitar a entrada de poeira.
nota: Outros solventes de fase móvel, como um tampão Tris, podem ser usados se proteínas adicionais que são preferencialmente dissolvidas nesses solventes forem analisadas.
- Lave durante a noite a uma taxa de fluxo de 0.5 mL / min, ou conforme recomendado pelo fabricante da coluna, para equilibrar a coluna no buffer e remover partículas. Use o modo de fluxo contínuo do FPLC e certifique-se de que o fluxo não pare até que todas as execuções SEC-MALS sejam concluídas.
- Coloque a célula de fluxo dRI no modo de purga durante a descarga noturna. Desligue a limpeza antes de iniciar as execuções de amostra.
- Ao iniciar a descarga, aumente gradualmente a vazão para evitar o efeito de "derramamento da coluna" (ou liberação de partículas) causado por uma mudança repentina de pressão na coluna.
- Se o sistema for conhecido por ser bastante estável e livre de partículas, e em equilíbrio com a fase móvel desejada, substitua a descarga noturna por uma descarga mais curta, de 2 a 3 horas.
- Verifique a limpeza do sistema batendo levemente na tubulação a jusante da coluna para liberar as partículas acumuladas e observando o sinal no detector de 90° no visor do painel frontal do instrumento MALS. Verifique se o ruído pico a pico não é superior a 50 -100 μV.
- Execute uma injeção 'em branco' para verificar se o injetor está livre de partículas. Um 'branco' é simplesmente o tampão de corrida, preparado em um frasco fresco e estéril.
- Se o pico de partículas não for superior a 1 mL em volume e não superior a 5 mV acima da linha de base, o sistema estará pronto para amostras. Caso contrário, execute injeções adicionais em branco até ficar limpo ou faça manutenção para limpar o injetor.
3. Preparando e carregando a amostra
- Prepare pelo menos 200 μL de BSA a 1-2 mg/mL no tampão SEC.
nota: Para evitar a precipitação, o BSA nunca deve ser dissolvido em água pura.
- Filtrar a proteína a 0,02 μm utilizando um filtro de ponta de seringa.
- Descarte as primeiras gotas de filtrado para eliminar as partículas dos filtros secos.
- Alternativamente, centrifugue a amostra a 10.000 x g por 15 min para permitir a precipitação de agregados não solúveis e outras partículas grandes.
- Injete 100 μL da solução de BSA no loop.
nota: Esta é a quantidade recomendada de material, podendo ser injectada mais ou menos de acordo com as circunstâncias da amostra, tais como estabilidade ou disponibilidade. A quantidade de proteína necessária por injeção varia inversamente com o peso molecular, duas vezes mais massa de proteína é necessária se o peso molecular for 33 kDa ou metade do BSA.
4. Preparação do software MALS
- Abrir Novo | Experimente a partir do método no menu do software MALS e selecione o método on-line na pasta de métodos do sistema de dispersão de luz. Se um detector DLS estiver presente, selecione o método Online na caixa de diálogo Dispersão de luz | Com pasta QELS.
- Na seção Configuração, defina os parâmetros da amostra e da fase móvel.
- Na visualização Bomba genérica, defina a taxa de fluxo para a usada no FPLC.
- Na exibição Bomba genérica, ramificação de solvente, campo Nome, selecione PBS.
- Na visualização Injetor, Ramificação de amostra, insira o Nome como BSA e defina dn/dc = 0,185 (o valor padrão para proteínas não modificadas), A2 = 0 e coeficiente de extinção UV = 0,667 mL/(mg-cm).
nota: Para outras proteínas, o coeficiente de extinção UV280 nm pode ser encontrado na literatura ou calculado a partir de sua sequência usando várias ferramentas de software de domínio público.
- Na seção Procedimentos, visualização Coleta Básica, marque a caixa de seleção Disparar na Injeção Automática e defina a duração da execução como 70 min para que os dados sejam coletados para toda a eluição até que o volume total de permeação da coluna SEC seja atingido.
nota: A quantidade de tempo necessária pode variar com a coluna e a taxa de fluxo - 35 min da coleta são necessários para uma coluna HPLC-SEC padrão de 7,8 mm x 300 mm a 0,5 mL/min.
- Inicie o experimento no software MALS clicando no botão Executar. Ele começará a ler os dados após receber o sinal de pulso do instrumento FPLC através do detector MALS.
- Zero o sinal dRI clicando no botão Autozero no painel frontal do instrumento.
5. Preparação do software FPLC
- Insira o nome da proteína e a corrida no software FPLC, em Manual | Executar instruções manuais | Marca definida.
- Mude a válvula injetora de Carga manual para Injetar no caminho do fluxo | Válvula de injeção.
- Inclua um sinal de pulso inserindo um pulso de 0,5 s sob a caixa de E/S | Saída digital de pulso. Isso acionará a coleta de dados no software MALS.
6. Injete a amostra no loop. Clique em Executar no software FPLC para iniciar a execução do experimento.