Purificação de afinidade de complementação bimolecular para isolar duas proteínas em interação

Resumo

Fonte: Hastings, J. F. et al. Dissecando complexos de sinalização multiproteica por purificação de afinidade de complementação bimolecular (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos a purificação de afinidade de complementação bimolecular, BiCAP, para detectar e isolar dímeros de proteínas específicos usando anticorpos de domínio único específicos de conformação.

Protocolo

1. Cultura de células e transfecção

NOTA: Para a transfecção dos vetores BiFC é importante obter uma transfecção de alta eficiência e relativamente homogênea. Os vetores provavelmente serão compatíveis com qualquer reagente de transfecção padrão e as condições de transfecção devem ser otimizadas de acordo. Para realizar espectrometria de massa, geralmente cultivamos células dentro de placas de 10 cm, embora isso também possa ser proporcionalmente reduzido para placas ou placas menores para experimentos que requerem menos material.

1. Semear 1,0 × 10⁶ células HEK293T em um prato de 10 cm com 10 mL de meio DMEM, suplementado com 10% de FBS e Penicilina/Estreptomicina (1:100).
2. Dilua 2,5 μg de cada vetor BiFC em 500 μL de tampão de transfecção (ver Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Adicione 10 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela de Materiais).
4. Mistura de vórtice por 10 s e, em seguida, centrifugue brevemente. Incube por 10 min em temperatura ambiente.
5. Adicione a mistura de transfecção de DNA à placa, gota a gota. Incubar as células por um período de tempo suficiente para que as proteínas de fusão BiFC interajam e para o dobramento de Vênus e maturação do fluoróforo, geralmente ~ 8 - 24 h.
   NOTA: O pico de excitação para Vênus é de 515 nm e seu pico de emissão é de 528 nm, embora isso seja facilmente visualizado usando um microscópio fluorescente padrão configurado para visualizar a fluorescência GFP.

2. Preparação da amostra

1. Colheita de lisados
   1. Antes da coleta do lisado, prepare o tampão de lise celular [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v / v) detergente não iônico (ver Tabela de Materiais)]. Conservar a 4 °C.
   2. Imediatamente antes da colheita, suplemente 10 mL de tampão de lise celular com inibidor de protease e inibidor de fosfatase (ver Tabela de Materiais). Mantenha o tampão de lise celular suplementado no gelo.
   3. Lave as células duas vezes em PBS gelado. Aspire o PBS e adicione 1 mL de tampão de lise celular suplementado com gelo. Coloque o prato no gelo, garantindo que o tampão esteja espalhado por toda a área da superfície.
   4. Incube no gelo por aproximadamente 5 min e, em seguida, use um raspador de células (consulte a Tabela de Materiais) para raspar as células e transferi-las para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mL.
   5. Remova os detritos celulares centrifugando o lisado coletado a 18.000 × g por 5 min a 4 ° C e transfira o sobrenadante limpo para tubos de microcentrífuga frescos.
      nota: Neste ponto, o lisado pode ser usado imediatamente ou armazenado a -80 °C. Recomenda-se também manter uma alíquota de lisado bruto para que a eficiência da transfecção e a purificação por afinidade possam ser validadas.
2. Purificação de afinidade
   nota: A etapa de isolamento do BiCAP é realizada usando o nanocorpo GFP conjugado a grânulos de agarose (ver Tabela de Materiais).
   1. Preparar as esferas de agarose lavando um volume adequado (20 μL por amostra + 10 μL de excesso) em 1 ml de PBS. Centrifugar os grânulos a 300 x g e retirar o sobrenadante.
   2. Adicione 20 μL a cada amostra de lisado.
   3. Incubar as amostras por 2 h a 4 °C com rotação de ponta a ponta.
      nota: Neste ponto, as amostras podem ser preparadas para SDS-PAGE e western blotting, ou análise por espectrometria de massa.
3. Preparação do eluente BiCAP para western blotting.
   1. Centrifugue os grânulos a 300 x g e lave-os três vezes no tampão de lise celular.
   2. Ressuspenda os grânulos lavados em 50 μL de tampão de amostra adequadamente diluído (consulte a Tabela de Materiais) e aqueça as amostras a 95 °C por 2-3 min.
      nota: As amostras preparadas desta forma podem ser armazenadas a -20 °C durante vários meses.
   3. Execute SDS-PAGE e western blotting para as tags V1 e V2 (consulte a Tabela de Materiais), bem como quaisquer outras proteínas de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Gibco	11995-073	Cultura de células
FBS	Tecnologias de Vida Austrália	Rolamento 10099-141	Cultura de células
Penicilina/estreptomicina	Tecnologias de Vida Austrália	15070-063	Cultura de células
tampão de transfecção jetPRIME	Poliplus	114-15	Cultura de células
reagente de transfecção jetPRIME	Poliplus	114-15	Cultura de células
PhosSTOP (inibidor da fosfatase)	Sigma-Aldrich	4906837001	Cultura de células
Coquetel de inibidores de protease completo, Mini e sem EDTA	Roche	11873580001	Artigos de plástico
Raspador de células	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Cromotek Gmbh	GTA-100	Nanocorpo GFP acoplado a grânulos de agarose
Anticorpo monoclonal N-terminal GFP	Covance	MMS-118P	Detectará a tag V1 nos vetores BiFC
Anticorpo monoclonal GFP C-terminal	Roche	11814460001	Detectará a tag V2 nos vetores BiFC
Tampão de amostra	Invitrogen	Rolamento NP0008	Suplementado com 1 mL de β-mercaptoetanol.
Tripsina modificada com grau de sequenciamento	Corporação Promega	V5117h	Cultura de células
Tubos de microcentrífuga LoBind	Diagnóstico no local de atendimento	Telefone: 0030 108 116	Artigos de plástico
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Preparado a 5 mg/ml em água ultrapura
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Células DH5α	Thermo Fisher		Células competentes para choques térmicos