Purificação de afinidade de complementação bimolecular para isolar duas proteínas em interação

Abstract

Fonte: Hastings, J. F. et al. Dissecando complexos de sinalização multiproteica por purificação de afinidade de complementação bimolecular (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos a purificação de afinidade de complementação bimolecular, BiCAP, para detectar e isolar dímeros de proteínas específicos usando anticorpos de domínio único específicos de conformação.

Protocol

1. Cultura de células e transfecção

NOTA: Para a transfecção dos vetores BiFC é importante obter uma transfecção de alta eficiência e relativamente homogênea. Os vetores provavelmente serão compatíveis com qualquer reagente de transfecção padrão e as condições de transfecção devem ser otimizadas de acordo. Para realizar espectrometria de massa, geralmente cultivamos células dentro de placas de 10 cm, embora isso também possa ser proporcionalmente reduzido para placas ou placas menores para experimentos que requerem menos material.

1. Semear 1,0 × 10⁶ células HEK293T em um prato de 10 cm ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11995-073	Cultura de células
FBS	Tecnologias de Vida Austrália	Rolamento 10099-141	Cultura de células
Penicilina/estreptomicina	Tecnologias de Vida Austrália	15070-063	Cultura de células
tampão de transfecção jetPRIME	Poliplus	114-15	Cultura de células
reagente de transfecção jetPRIME	Poliplus	114-15	Cultura de células
PhosSTOP (inibidor da fosfatase)	Sigma-Aldrich	4906837001	Cultura de células
Coquetel de inibidores de protease completo, Mini e sem EDTA	Roche	11873580001	Artigos de plástico
Raspador de células	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Cromotek Gmbh	GTA-100	Nanocorpo GFP acoplado a grânulos de agarose
Anticorpo monoclonal N-terminal GFP	Covance	MMS-118P	Detectará a tag V1 nos vetores BiFC
Anticorpo monoclonal GFP C-terminal	Roche	11814460001	Detectará a tag V2 nos vetores BiFC
Tampão de amostra	Invitrogen	Rolamento NP0008	Suplementado com 1 mL de β-mercaptoetanol.
Tripsina modificada com grau de sequenciamento	Corporação Promega	V5117h	Cultura de células
Tubos de microcentrífuga LoBind	Diagnóstico no local de atendimento	Telefone: 0030 108 116	Artigos de plástico
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Preparado a 5 mg/ml em água ultrapura
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Células DH5α	Thermo Fisher		Células competentes para choques térmicos