1. Preparação da amostra
- Purifique a biomolécula desejada.
nota: Este protocolo usa aptâmero de DNA de ligação à cocaína comprado MN4 após a troca contra NaCl 2 M três vezes, seguido por três rodadas de água deionizada usando um filtro centrífugo com uma membrana de corte de peso molecular de 3 kDa.
- Sintetize e purifique ou compre o ligante termolábil desejado.
nota: O MN4 se liga ao ligante termolábil cocaína. O MN4 também se liga ao quinino, que é usado como controle negativo para a termolabilidade do ligante nessas temperaturas experimentais.
- Preparar tampões para diálise da biomolécula purificada e dissolução de ligantes (fosfato de sódio 20 mM e tampão NaCl 140 mM, pH 7,4, para MN4 e os ligantes aqui utilizados).
- Dialisar a biomolécula contra pelo menos 2 L do tampão utilizando tubos de diálise com corte de 0,5 - 1,0 kDa.
- Filtre o tampão final (referido como tampão de trabalho) através de um filtro de 0,2 μm que tenha sido completamente equilibrado com o tampão.
- Pese as massas desejadas dos ligantes e dissolva-as em um tampão de trabalho filtrado. Se as concentrações de ligante desejadas exigirem massas muito pequenas para pesar com precisão, faça uma solução de estoque de ligante concentrada (10x, por exemplo).
nota: É crucial que todos os experimentos de DSC utilizem o mesmo buffer de trabalho para a amostra e o ligante, ou seja, nunca realizem um experimento em que o ligante seja dissolvido em um lote diferente de buffer de trabalho do que a biomolécula, pois isso causará artefatos de incompatibilidade de buffer nos dados.
- Filtrar a solução-mãe de biomoléculas através de um filtro de 0,2 μm que tenha sido completamente equilibrado com o tampão de trabalho.
- Determine a concentração da biomolécula por medições de absorbância (260 nm para ácidos nucléicos como MN4 e 280 nm para proteínas).
- Armazene a biomolécula e o ligante preparados em uma geladeira a 4 ° C (adequado para MN4 e os ligantes usados aqui), ou a -20 ou -80 ° C se a biomolécula e os ligantes tolerarem o congelamento e o armazenamento de longo prazo for necessário. Desgaseifique as soluções de tampão, biomolécula e ligante em um desgaseificador de mesa (consulte a Tabela de Materiais) antes de carregar no DSC.
nota: A desgaseificação ajuda a prevenir a formação de bolhas no DSC em temperaturas mais altas. As bolhas causam artefatos de sinal que obscurecem as formas de pico e as linhas de base da DSC.
2. Preparação do DSC
- Desaperte a alavanca de pressão do DSC (consulte a Tabela de Materiais).
- Passe a tubulação de silicone do buffer de trabalho e conecte-a ao flange frontal (abertura de metal) do capilar de referência.
- Crie uma ponte entre os capilares de referência e de amostra conectando o flange de referência traseiro ao flange de amostra frontal.
- Conecte um pedaço de tubo de silício ao flange de amostra traseiro que corre para um frasco de resíduos com uma linha de vácuo conectada.
- Ligue a linha de vácuo para lavar o DSC com 200 mL de tampão de trabalho.
- Carregue o capilar de referência do DSC com o tampão de trabalho. Fixe seções de aproximadamente 3 a 5 cm de tubo de silicone aos flanges capilares de referência.
- Insira uma ponta de pipeta de 1 mL no tubo de silicone do flange traseiro. Retire 0,8 mL de tampão de trabalho com uma pipeta e insira a ponta da pipeta com tampão no tubo de silicone do flange de referência frontal.
- Pressione suavemente o êmbolo da pipeta para baixo para passar o tampão de trabalho através do tubo de silicone frontal para o capilar de referência e para cima na ponta da pipeta anexada ao flange traseiro. Pressione o êmbolo da pipeta até que o nível do buffer de trabalho atinja logo acima do tubo de silício frontal e, em seguida, solte o êmbolo da pipeta até que o nível do buffer de trabalho atinja logo acima do tubo de silício traseiro.
- Repita a passagem do buffer de trabalho para frente e para trás para purgar o volume no capilar de referência das bolhas.
nota: Normalmente, 10 passagens da solução para frente e para trás são suficientes para limpar as bolhas.
- Tampe a ponta da pipeta traseira com o polegar e puxe suavemente a ponta da pipeta traseira e a pipeta frontal para removê-las dos flanges de referência com o tubo de silicone conectado.
- Carregue o capilar de amostra com o tampão de trabalho como nas etapas 2.6 - 2.9. Coloque uma tampa de plástico preta na referência traseira e sample flanges, deixando os flanges frontais descobertos.
- Encaixe a alça de pressão.
- Abra o software DSC (consulte a Tabela de Materiais) e pressurize o instrumento clicando na seta vermelha para cima na parte superior da interface assim que a leitura de energia se estabilizar; a potência DSC é indicada em uma caixa no canto superior direito da interface junto com a leitura de temperatura e pressão do instrumento.
nota: Monitore a leitura de energia à medida que o DSC pressuriza. Mudanças na potência de mais de ~ 10 μW indicam formação de bolhas nos capilares, o que pode causar artefatos nos dados. As soluções devem ser removidas e desgaseificadas antes de continuar.
- Equilibre o DSC com o buffer de trabalho executando uma varredura direta e reversa. Na aba "Método Experimental" no lado esquerdo da tela, certifique-se de que a opção "Varredura" esteja selecionada para executar o DSC no modo de varredura de temperatura.
nota: Os parâmetros experimentais são a faixa de varredura de temperatura, taxa de varredura, tempo de equilíbrio de baixa e alta temperatura e número de varreduras.
- Na inserção "Parâmetros de temperatura" na guia "Método experimental", clique no botão "Aquecimento". Insira 1 e 100 °C para as temperaturas experimentais inferior e superior, 1 °C/min para a taxa de varredura e 60 s para o período de equilíbrio.
- Clique no botão "Adicionar série" no campo de entrada para o período de equilíbrio. Digite 2 no campo "Etapas para adicionar" na janela pop-up (para uma verificação de aquecimento e uma verificação de resfriamento) e marque a caixa "Aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em "OK"; As varreduras adicionadas aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros de cada varredura são os desejados.
- Inicie o experimento clicando no botão verde "play" na parte superior da interface. Navegue até a pasta desejada e insira um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up. Visualize o progresso do experimento clicando na guia "Dados" à direita da guia "Método do experimento".
3. Coletando conjuntos de dados de DSC de ligantes termolábeis
NOTA: O procedimento mínimo consiste em cinco experimentos: experimentos de referência de tampão com e sem ligante (usado para subtração de linha de base), experimentos de amostra com a biomolécula livre, a biomolécula ligada ao ligante e a biomolécula ligada ao ligante com um período de equilíbrio de alta temperatura mais longo.
- Execute experimentos de referência para subtração de linha de base dos dados de amostra. Recarregar o DSC com o tampão de trabalho em ambos os capilares e recolher vários varrimentos para a frente e para trás numa gama de temperaturas adequada a 1 °C min-1 com um tempo de equilíbrio superior (alta temperatura) de 120 s.
- Exclua as verificações de equilíbrio de buffer anteriores da parte inferior da interface destacando cada uma individualmente e clicando no X vermelho no meio direito da interface. Adicione as novas digitalizações clicando no botão "Adicionar série", digitando 20 no campo "Etapas para adicionar" e marcando a caixa "Aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em OK e execute o experimento clicando no botão verde de reprodução como acima.
- Repita as etapas 3.1 - 3.1.1 com o tampão de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambos os capilares para obter os experimentos de referência para o ligante (colete dois experimentos separados usando tempos de equilíbrio de alta temperatura de 120 s e 600 s, respectivamente, para serem usados na aquisição da constante de taxa para conversão de ligante termolábil).
nota: A taxa de varredura usada aqui garante que a biomolécula em experimentos subsequentes esteja em equilíbrio térmico nas varreduras direta e reversa. Taxas de varredura < 0,1 - 0,2 ° C min-1 levam a termogramas ruidosos e não são aplicáveis em experimentos de DSC. As temperaturas devem se estender de bem abaixo da temperatura de fusão da biomolécula livre até bem acima da temperatura de fusão da biomolécula saturada de ligante (~ 20 - 80 ° C para MN4). Verifique a reprodutibilidade das varreduras (por exemplo, 10 varreduras diretas e 10 reversas para 20 no total são suficientes).
- Se estiver usando vários ligantes (como cocaína e quinino), lave o DSC com 200 mL de tampão de trabalho (repita a partir da etapa 2.5) entre as execuções para remover os ligantes dos capilares e evitar a contaminação cruzada.
nota: É útil realizar um experimento replicado na biomolécula livre após uma corrida ligada ao ligante, a fim de verificar se o ligante anterior adsorve fortemente nas paredes capilares e não é removido adequadamente com lavagem do tampão. Se os termogramas para a biomolécula livre parecerem ser deslocados para uma magnitude maior e temperatura de desnaturação mais alta após o experimento ligado ao ligante, é provável que o ligante anterior ainda esteja presente no calorímetro após a lavagem. Remova o ligante adsorvido incubando os capilares com 20% de Contrad-70 por 1 h a 60 ° C com as tampas plásticas e a alça de pressão desligadas. No software DSC, altere o modo experimental para "Isotérmico" na guia Método experimental. Escolha 3.600 s para a duração e 60 ° C para a temperatura isotérmica, com zero inserido para o tempo de equilíbrio. Clique em "Adicionar ao método experimental". O experimento isotérmico aparece na parte inferior da tela. Após a conclusão, lave o instrumento com 2 L de água deionizada e repita a partir da etapa 2.5.
- Execute experimentos de amostra usando o mesmo procedimento de carregamento de DSC e parâmetros experimentais que as varreduras de referência. Para o conjunto de dados de biomolécula livre, certifique-se de que o capilar de referência contém o tampão de trabalho, enquanto o capilar de amostra contém a biomolécula livre na concentração desejada no tampão de trabalho.
- Para os experimentos ligados ao ligante, certifique-se de que o ligante esteja no tampão de trabalho no capilar de referência e que a biomolécula mais o ligante esteja no tampão de trabalho no capilar da amostra. Lave o sistema entre adições de diferentes ligantes como na etapa 2.5.
- Realizar um experimento adicional com a biomolécula ligada ao ligante termolábil, onde o período de equilíbrio de alta temperatura é aumentado para 600 s e todos os outros parâmetros experimentais são os mesmos da etapa 3.2.1.
nota: A duração do período de equilíbrio de alta temperatura para o segundo experimento ligado ao ligante é simplesmente escolhida para garantir que o ligante seja esgotado mais rapidamente do que o experimento de tempo de equilíbrio curto. Se os picos ligados ao ligante do primeiro experimento decaem lentamente em função do número de varredura (por exemplo, as diferenças nos máximos de pico sucessivos são ≤ 0,5 ° C), estime aumentos de 10 a 20 vezes no período de equilíbrio de alta temperatura para esgotar adequadamente o ligante durante o segundo experimento. O cálculo preciso da constante de taxa para conversão de ligante requer que o segundo experimento tenha uma depleção mais rápida do ligante em relação ao primeiro. As concentrações de ligantes extraídas da análise global dos dois experimentos serão semelhantes e, portanto, inutilizáveis se a depleção do ligante não for suficientemente acelerada no segundo experimento.
4. Processamento de dados
- Abra os arquivos de experimento DSC no software de análise de dados DSC (consulte Tabela de materiais) e exporte os dados de energia bruta como planilhas.
- Importe as planilhas contendo os dados de potência bruta para o software para ajuste de dados.
- Linha de base: subtraia os dados da amostra subtraindo os dados de potência do tampão dos experimentos de biomoléculas livres e ligadas a ligantes.
nota: Para o experimento do ligante termolábil, a concentração do ligante inicial está diminuindo a cada varredura. Portanto, é ideal subtrair a varredura de buffer 1 da varredura de amostra 1 e assim por diante. Descobrimos que as varreduras de buffer com cocaína não mudam sensivelmente à medida que a conversão do ligante prossegue e, portanto, uma única varredura de buffer de ligante termolábil pode ser usada para subtrair todos os dados ligados ao ligante termolábil.
- Converta os dados de potência amostral subtraídos da linha de base em capacidade de calor.
nota: A conversão requer o volume específico parcial da biomolécula, que pode ser estimado.
5. Análise dos dados
- Ajuste globalmente o conjunto de dados de capacidade térmica ligada ao ligante termolábil de tempo de equilíbrio curto com um único conjunto de parâmetros de linha de base, concentração de ligante, dobramento e ligação de ligante.
- Repita o ajuste global para o conjunto de dados de tempo de equilíbrio longo para calcular a constante de taxa para conversão de ligantes termolábeis.
