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1. Preparação de CXCL12, tampão de ensaio e células Jurkat para o ensaio de ligação de competição
- Prepare uma solução estoque de CXCL12AF647 (20 μg / mL; consulte a Tabela de Materiais e Reagentes) dissolvendo o reagente liofilizado (armazenado a -80 ° C, no escuro) em água ultrapura suplementada com 0,01% (volume / volume) de Polissorbato 20. Armazenar alíquotas descartáveis desta solução-mãe a -80 °C, protegidas da luz.
- Prepare o tampão do ensaio adicionando 40 mL de HEPES (1 M, concentração final de 20 mM) a 200 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS, 10x, sem vermelho de fenol e sem bicarbonato de sódio, 1x concentração final). Adicione água ultrapura para obter um volume final de 2 L. Adicione 4 g (0,2% peso / volume) de albumina de soro bovino (BSA) e dissolva o BSA por agitação magnética. Finalmente, ajuste o pH para 7,4 (use NaOH para isso) e filtre a solução através de poros de 0,2 μm (consulte a Tabela de Materiais e Reagentes) usando um coletor de vácuo.
NOTA: Este tampão de ensaio será usado em todas as etapas posteriores do protocolo.
- Conte o número e a viabilidade das células de Jurkat. Para isso, pegue uma amostra da suspensão celular e dilua-a em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
nota: Usamos rotineiramente um analisador automatizado de viabilidade celular (ver Tabela de Materiais e Reagentes) capaz de contar suspensões celulares em concentrações variadas. Para contagem de células, dilua 0,5 mL de suspensão celular em 1,5 mL de PBS (outras diluições, por exemplo, 0,1 mL em 1,9 mL de PBS, também são possíveis). Vários outros dispositivos estão disponíveis comercialmente para contar o número de células e a viabilidade que devem funcionar igualmente bem.
- Colete o número desejado de células (ou seja, ~ 24 x 106 células para executar o ensaio com uma placa completa de 96 poços) em um tubo estéril de 50 mL por centrifugação (consulte a Tabela de Materiais e Reagentes para o tipo de centrífuga usada) a 400 x g por 5 min em RT.
- Despeje suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Adicione um novo tampão de ensaio (por exemplo, 20 mL) e ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo.
- Centrifugue as células novamente a 400 x g por 5 min em RT.
- Despeje o sobrenadante novamente e ressuspenda o pellet celular em tampão de ensaio fresco para obter uma densidade de 5 x 106 células / mL.
2. Ensaio de Competição Vinculativa
NOTA: O ensaio de ligação de competição real é realizado em RT e pode ser realizado em condições não estéreis.
- Diluir os compostos sob investigação em tampão de ensaio (ver 1.2) para obter a concentração desejada. Prepare uma concentração fixa do composto para triagem inicial (por exemplo, concentração final de 10 μM) ou, alternativamente, uma série de concentrações de diluição em série para uma caracterização mais detalhada dos compostos (por exemplo, uma série de diluição de 1/3, 1/4 ou 1/5 começando em 1 μM, concentração final). Lembre-se de que a solução composta acabará sendo 2x diluída no ensaio; portanto, prepare uma solução concentrada 2x.
- Dispense 100 μL de solução composta (2x concentrada) em uma placa de fundo redonda transparente de 96 poços (consulte a Tabela de Materiais e Reagentes) de acordo com um layout experimental predefinido (por exemplo, Figura 1C).
NOTA: Nesta fase, as amostras de controlo negativo e positivo são incluídas no ensaio. Na amostra de controle negativo, 100 μL de tampão de ensaio são adicionados em vez do composto aos poços da placa de 96 poços. Para a amostra de controle positivo, um tampão de ensaio também é adicionado durante esta etapa. Ver também a figura 1C para um esquema experimental típico em que é ensaiada uma série de diluições de vários compostos.
- Adicione 50 μL de suspensão celular (ver 1,7; 0,25 x 106 células) de um reservatório de reagente na placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Incube a placa por 15 min em RT no escuro.
- Adicione 50 μL de CXCL12 marcado com fluorescência (ou seja, 100 ng/mL de CXCL12AF647 em tampão de ensaio, 4x concentrado, concentração final de 25 ng/mL) de um reservatório de reagente semelhante aos poços da placa de 96 poços. Incubar por 30 min em RT no escuro.
nota: Para as amostras de controle negativo, adicione tampão de ensaio. Assim, o sinal fluorescente detectado nas amostras de controle negativo corresponderá ao sinal de fundo autofluorescente (Figura 1A). Para as amostras de controle positivo, adicione 50 μL / poço de CXCL12AF647. As amostras de controle positivo produzirão o sinal de fluorescência máxima detectado, uma vez que nenhuma inibição potencial por pré-incubação com compostos foi incluída (Figura 1A).
- Centrifugue a placa de 96 poços a 400 x g por 5 min em RT. Remova o sobrenadante das células peletizadas virando a placa. Seque o prato em um lenço de papel.
- Adicione 200 μL de tampão de ensaio fresco de um reservatório de reagente aos poços usando uma pipeta multicanal. Prossiga imediatamente.
- Centrifugue novamente a placa durante 5 minutos a 400 x g em RT. Retirar o sobrenadante virando a placa e secá-la novamente sobre um lenço de papel.
- Ressuspenda suavemente o pellet celular em 200 μL de paraformaldeído a 1% dissolvido em PBS. Esta etapa corrigirá as células.
- Continuar imediatamente o protocolo com a quantificação da fluorescência por citometria de fluxo.
3. Análise das amostras por citometria de fluxo
CXCL12 As células coradas e fixadasAF647 estão agora prontas para serem analisadas usando citometria de fluxo. Vários tipos de citômetros de fluxo podem ser usados, mas eles precisam ser equipados com o laser correto (ou seja, um laser vermelho, faixa de excitação ~ 630 nm) para excitação e filtros adequados para detecção de fluoróforo (filtros de emissão ~ 660 nm). Eles precisam ser capazes de lidar com amostras em um formato de placa de 96 poços. Exemplos de dispositivos de citometria de fluxo adequados são dados na Tabela de Materiais e Reagentes.
- Inicie o dispositivo e abra o software correspondente (consulte Tabela de Materiais e Reagentes).
- Selecione os seguintes parâmetros celulares a serem visualizados em um formato de dot blot: dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) e canal de detecção de fluoróforo (CXCL12AF647).
nota: Com o parâmetro FSC, as células são discriminadas com base em seu tamanho, uma vez que a absorção de luz detectada é proporcional ao diâmetro da célula. O parâmetro SSC, medindo o espalhamento de luz em um ângulo de 90°, fornece informações sobre a granularidade das células.
- Escolha uma amostra (por exemplo, uma amostra de controle negativo) para realizar o gating de uma população de células homogênea definida com base nos parâmetros FSC e SSC.
- Selecione a injeção automática de ~ 100 μL de células fixadas desta amostra de controle negativo no citômetro de fluxo. Selecione a opção "misturar" antes da injeção e use uma taxa de fluxo de amostra de 1,5 μL / s.
- Execute este exemplo selecionando "Adquirir dados". Os parâmetros FSC e SSC para este exemplo agora aparecerão na tela.
- Selecione a ferramenta de gating do software. Com base na visualização de dot blot FSC e SSC, pré-defina uma população de células homogênea e viável por gating. Para fazer isso, crie um polígono (usando a ferramenta de gating do software) que inclua as células únicas distribuídas de forma homogênea ("eventos") com base nessas duas dimensões.
nota: O procedimento de gating visa definir uma população de células homogênea e viável que será usada para análises posteriores. O gating baseia-se na suposição de que a maioria das células viáveis formará uma população de células homogênea com base nos parâmetros FSC e SSC. Ao realizar esta etapa, detritos celulares, células mortas e agregados celulares podem ser amplamente excluídos de análises posteriores. Uma ilustração do processo de gating é dada na Figura 1B.
- Selecione para analisar 20.000 "eventos" (ou seja, células únicas) por amostra.
nota: Isso significa que, para cada amostra, 20.000 células que se enquadram na porta pré-definida serão eventualmente analisadas. A aquisição de dados para cada amostra continuará até que esse número de eventos seja analisado.
- Inicie a execução (selecione "Gravar dados"). O dispositivo de citometria de fluxo agora analisará todas as amostras uma a uma, registrando a intensidade média de fluorescência (MFI) para cada amostra. Este MFI corresponde ao sinal fluorescente médio correspondente às 20.000 células que se enquadram na porta pré-definida.
