Ensaio repórter baseado em ELISA para estudar a interação receptor-ligante em células BW

Neste artigo

Resumo

Fonte: Elias, S. et al., Um sistema BW Reporter para estudar interações receptor-ligante. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a detecção baseada em ensaio repórter da interação receptor-ligante. A interação receptor-ligante bem-sucedida ativa a via de sinalização a jusante, causando a geração e liberação de citocinas como moléculas repórter secretoras na solução, o que é confirmado usando ELISA.

Protocolo

1. Geração de um plasmídeo que expressa a construção quimérica

NOTA: O objetivo é gerar um plasmídeo que expresse o domínio extracelular do receptor de interesse fundido aos domínios transmembrana e intracelular da cadeia CD3ζ de camundongo (Figura 1A).

Recupere a sequência do domínio extracelular do receptor de interesse, incluindo o peptídeo sinal. Obtenha material de DNA que se espera que expresse esse receptor (por exemplo, cDNA ou um plasmídeo).
Obtenha material de DNA que expresse a transmembrana e os domínios intracelulares da cadeia CD3ζ de camundongo ....

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Resultados

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Figura 1: A estrutura do receptor quimérico-CD3ζ e o design dos primers de PCR. (A) Estrutura geral de um receptor extracelular fundido aos domínios transmembrana e intracelular de CD3ζ de camundongo. (B) O domínio extracelular do receptor foi amplificado com um primer 3 'que também incluía nucleotídeos de CD3ζ. (C) Os domínios intracelular e transmembrana de CD3ζ foram amplificados com um primer 5 '.......