1. Geração de um plasmídeo que expressa a construção quimérica
NOTA: O objetivo é gerar um plasmídeo que expresse o domínio extracelular do receptor de interesse fundido aos domínios transmembrana e intracelular da cadeia CD3ζ de camundongo (Figura 1A).
- Recupere a sequência do domínio extracelular do receptor de interesse, incluindo o peptídeo sinal. Obtenha material de DNA que se espera que expresse esse receptor (por exemplo, cDNA ou um plasmídeo).
- Obtenha material de DNA que expresse a transmembrana e os domínios intracelulares da cadeia CD3ζ de camundongo (por exemplo, cDNA ou um plasmídeo).
- Projete a sequência da proteína de fusão com base na estrutura geral mostrada na Figura 1A. Certifique-se de que toda a sequência esteja dentro do mesmo quadro de leitura de códons. Esta sequência é usada para projetar primers apropriados e verificar o produto final.
- Projete duas reações de PCR para amplificar cada um dos fragmentos das proteínas de fusão separadamente (Figura 1B, 1C).
nota: As condições específicas para as reações de PCR (por exemplo, tempo de alongamento e temperatura de recozimento) dependem da natureza dos primers, que são projetados para um receptor específico.
- Amplificar o segmento extracelular do receptor.
- Projete um primer 5 'que inclua parte do peptídeo sinal do receptor, uma sequência de consenso de Kozak e um local de restrição apropriado ( Figura 1B ).
- Projete um primer 3 'que flanqueia ambas as partes da proteína de fusão ( Figura 1B ). Por exemplo, para o desenho inicial, este primer 3' pode incluir os últimos 20 pares de bases do segmento extracelular do receptor e os primeiros 9 pares de bases do segmento CD3ζ.
nota: Não há necessidade de adicionar um local de restrição ao primer 3', pois esse primer será usado para gerar a sequência fundida e não é usado para ligadura.
- Amplificar o segmento CD3ζ.
- Projete um primer de 5 'que flanqueia ambas as partes da proteína de fusão ( Figura 1C ). Por exemplo, para o desenho inicial, o primer 5' pode incluir os últimos 9 pares de bases do segmento extracelular do receptor e os primeiros 20 pares de bases do segmento CD3ζ.
nota: Não há necessidade de adicionar um local de restrição ao primer 5', pois esse primer será usado para gerar a sequência fundida e não é usado para ligadura.
- Projete um primer 3 'que inclua o final da sequência CD3ζ, bem como um local de restrição apropriado ( Figura 1C ).
- Corrija as sequências de primer em cada uma dessas duas reações para que a temperatura de recozimento seja semelhante em cada par (observe que o primer, que inclui sequências das duas partes da proteína de fusão, apenas recoze com parte da sequência em cada reação).
- Realize uma PCR adicional na qual uma mistura dos produtos de PCR das duas primeiras reações é usada como molde de DNA com o primer 5 'do segmento receptor extracelular (Etapa 1.4.1.1) e o 3' do segmento CD3ζ (Etapa 1.4.2.2) (Figura 1D). Esta reação deve gerar a sequência final fundida.
- Proceda como de costume para clonagem.
- Ligue o produto final da PCR ao vetor de corte alvo (o vetor alvo é geralmente pcDNA3, que expressa resistência a G418 e ampicilina).
- Transforme o vetor ligado em bactérias competentes.
- Descongelar 50 μL das bactérias competentes no gelo.
- Adicione o vetor ligado à bactéria e incube no gelo por 20 min.
- Incubar a 42 °C durante 45 s.
- Adicione 200 μL de LB sem antibióticos.
- Incubar durante 1 h a 37 °C com agitação contínua.
- Semeie em uma placa LB com os antibióticos apropriados (por exemplo, solução de ampicilina com concentração final de 0,1 mg/mL).
- Colete e cultive várias colônias bacterianas em 5 mL de LB (em tubos de 15 mL).
- No dia seguinte, extraia os plasmídeos com um kit de mini-preparação.
- Analise a inserção do gene com enzimas de restrição.
- Sequencie as colônias relevantes e verifique se a sequência e o quadro de leitura estão corretos (conforme indicado na Etapa 1.3).
- Transforme o plasmídeo verificado em bactérias competentes.
- Descongelar 20 μL das bactérias competentes no gelo.
- Adicione 1 μL do plasmídeo à bactéria e incube no gelo por 20 min.
- Incubar a 42 °C durante 45 s.
- Adicione 200 μL de LB sem antibióticos.
- Incubar durante 1 h a 37 °C com agitação contínua.
- Semeie em uma placa de crescimento bacteriano com os antibióticos apropriados (por exemplo, solução de ampicilina com uma concentração final de 0,1 mg / mL).
- No dia seguinte, cultive uma colônia bacteriana em um grande recipiente LB com 0,1 mg / mL de ampicilina (~ 250 mL).
- No dia seguinte, realize a maxi prep de acordo com as instruções específicas fornecidas pelo kit.
nota: Para o procedimento de eletroporação, é necessária uma grande quantidade de plasmídeo, conforme detalhado abaixo.
2. Transfecção do plasmídeo que expressa a proteína quimérica em células BW
NOTA: Diferentes métodos também podem ser empregados para transfecção (por exemplo, por infecção lentiviral). Antes da eletroporação, execute a precipitação de etanol do DNA conforme descrito abaixo. As próximas etapas exigem condições estéreis.
- No dia anterior, prepare as células BW5147 ("células BW") para eletroporação. Placa 10 placas (de 10 cm) com 10 mL de 100.000 células BW5147/mL (ou seja, um total de 10 x 106 células) com RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de piruvato de sódio, 1% de L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de penicilina-estreptomicina ("meio completo").
- Coloque 100 μg do plasmídeo pcDNA3 que expressa a proteína de fusão em um tubo de 1,5-2 mL e adicione acetato de sódio 3 M a pH 5,3-5,5. O volume do acetato de sódio deve corresponder a 0,1 (10%) do volume do plasmídeo de 100 μg; titular o pH do acetato de sódio com um medidor de pH adicionando NaOH ou HCl.
- Adicione 2,5 volumes de etanol 100% à mistura do plasmídeo e do acetato de sódio, conforme descrito na Etapa 2.2 (2,5x o volume total de plasmídeo e acetato de sódio). Incubar durante a noite a -20 °C ou durante 2 h a 70 °C.
- 24 h após as células BW terem sido plaqueadas, recolher todas as células BW (~100 mL) em 2 tubos de 50 mL. Centrifugue as células por 5 min a 515 x g e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet de ambos os tubos em 25 mL de RPMI - em um único tubo de 50 mL. Por exemplo, ressuspenda o pellet de um tubo com 25 mL de RPMI- e, em seguida, use esse fluido para ressuspender o fluido no outro tubo de 50 mL para que o pellet total das células BW seja ressuspenso em 25 mL de meio em um único tubo.
nota: O meio deve ser sem adições, pois o soro pode interferir na eletroporação.
- Centrifugue as células novamente por 5 min a 515 x g. Ressuspenda o pellet em 1 mL de RPMI e transfira o conteúdo para uma cubeta de 0,4 cm no gelo.
- Centrifugue o plasmídeo submetido à precipitação de etanol (Etapa 2.3) por 30 min a 16.000 x g e 4 °C.
- Lave uma vez com 1 mL de etanol a 70% e centrifugue por mais 20 min a 16.000 x g e 4 ° C (para lavar o sal).
- Remova todo o etanol e deixe o pellet secar um pouco (ou seja, em um tubo aberto na capa de cultura de tecidos). Ressuspenda o pellet com 100 μL de RPMI - previamente aquecido a 60 °C.
- Adicione o plasmídeo ressuspenso (Etapa 2.8) às células da cubeta e incube por 5 min no gelo.
- Eletroporar as células a 0,23 kV, 250 capacitação. Isso deve levar ~ 4 ms.
- Transferir as células electroporadas para um tubo de 50 ml, adicionar 50 ml de meio completo e centrifugar durante 5 min a 5,15 x g.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células com 50 ml de meio completo.
- Coloque as células eletroporadas em placas de cultura de 24 poços (1 mL por poço, para um total de ~ 50 poços) e incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 48 h.
- Selecione as células transfectadas com antibióticos. Após 48 h, adicionar 1 mL de meio completo suplementado com 10 mg/mL de G418 em cada poço (nesta fase, o volume final em cada poço é de 2 mL e a concentração final de G418 em cada poço é de 5 mg/mL).
nota: Se o plasmídeo contiver uma resistência antibiótica diferente, determine a concentração de antibióticos necessária para matar as células BW não transfectadas antes desta etapa.
- A cada 48 h, descarte cuidadosamente 1 mL do volume superior de cada poço sem mexer o meio no poço (as células BW tendem a estar no fundo do poço). Adicione meio completo suplementado com 5 mg / mL G418 a cada poço, de modo que o volume final em cada poço seja novamente de 2 mL.
- Examine as placas de cultura para o crescimento celular em todos os poços regularmente.
nota: Uma mudança na cor do meio para amarelo pode ajudar a identificar células em crescimento; no entanto, no início, o meio será amarelo por causa do próprio G418. Identifique poços positivos (poços com células em crescimento). Esses poços são resistentes ao G418 e, portanto, espera-se que expressem a proteína de fusão. Esse processo geralmente leva ~ 3 semanas.
3. Verificação da expressão do receptor transfectado em células nos poços positivos.
- Corar as células BW transfectadas com um anticorpo específico contra o receptor que foi transfectado.
- Comparar o nível de expressão do receptor por citometria de fluxo com a expressão das células de controle (células BW não transfectadas).
- Após a verificação de um ou mais poços, use as células imediatamente para fins experimentais, cultive-as em cultura ou congele-as para aplicações futuras.
- Verifique a expressão do receptor transfectado antes de realizar um novo experimento. Após algumas semanas de crescimento, as células com G418 com expressão de receptor estável, G418 podem ser omitidas do meio de cultura.
4. Incubação das células BW transfectadas com alvos
NOTA: Ao usar as células BW transfectadas pela primeira vez, é preferível testá-las em alvos que expressam um ligante conhecido do receptor de interesse ou em anticorpos ligados à placa especificamente direcionados contra o receptor de interesse (experimentos de reticulação; veja abaixo, seção 4.2.1.3).
- De preferência, dividir as células BW 24 h antes do experimento (por exemplo, adicionando 10 mL de meio completo a 2 mL de células em cultura em uma nova placa de cultura de 10 cm).
- Incube as células BW transfectadas com seus alvos. Realize o experimento simultaneamente em células BW de controle que expressam um vetor vazio (ou células BW parentais). Placas 96F são preferíveis (mas placas 96U também podem ser usadas). Realizar a experiência em triplicado. Suspenda todas as células no meio completo.
- Prepare os alvos. O tipo de alvo varia em função do objetivo e pode ser células, células que foram pré-incubadas com anticorpos ou anticorpos sozinhos. Este sistema também tem sido usado com bactérias como alvos.
- Se os alvos forem células em divisão (ou seja, linhagens celulares), irradie-os a 6.000 rad antes do ensaio. Coloque 50.000 das células-alvo em um único poço de uma placa de 96 (em um volume de 100 μL).
- Para experimentos com anticorpos e células BW que expressam FcγRs humanos, incube as células-alvo com um anticorpo em gelo em uma placa de 96 poços (por exemplo, 50 μL das células-alvo e 50 μL do anticorpo; diferentes doses de anticorpos podem ser testadas).
- Se usarem anticorpos sozinhos como alvos (experimentos de reticulação), eles devem ser ligados à placa. Para este fim, primeiro incube os anticorpos em um meio completo em uma placa 96F por 1-2 h a 37 ° C e 5% de CO2 (uma dose inicial típica é de 0,5 μg de um anticorpo específico em 50 μL). Lave a placa para remover anticorpos não ligados.
nota: Nesse caso, uma placa 96F permitirá a ligação do anticorpo à placa, que após a adição das células BW transfectadas levará à ativação do receptor transfectado.
- Adicione as células BW (células efetoras). Coloque 50.000 células BW em um único poço de uma placa de 96 (em um volume de 100 μL).
- Complete o volume em cada poço para 200 μL, se necessário.
- Incubar as placas a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 h (este período de tempo pode ser calibrado).
- Após 48 h, congele as placas a -20°C e descongele-as antes do ELISA, ou use-as imediatamente para ELISA (veja as próximas etapas).
5. ELISA
- Cubra uma placa ELISA com um anticorpo anti-camundongo IL-2 (anti-mIL-2). Coloque 0,05 μg de anti-mIL-2 em um volume de 50 μL de 1x PBS (solução salina tampão fosfato) por poço. Incubar a placa ELISA revestida com o anticorpo anti-mIL-2 a 4 °C durante a noite ou a 37 °C durante 2 h.
nota: Para realizar ELISA diretamente após a etapa de incubação, a placa ELISA deve ser revestida 24 h antes do final do período de incubação das células BW.
- Descarte o fluido na placa ELISA e adicione uma solução de bloqueio (200 μL por poço) que é composta por 1x PBS e 1% de albumina de soro bovino (BSA). Incubar a placa ELISA durante 2 h à temperatura ambiente.
- Lave a placa ELISA três vezes com solução de PBS Tween a 0,05% (ou seja, 0,5 mL de Tween-20 em 1 litro de 1x PBS).
- Pegue a placa 96 que contém as células BW que foram incubadas com seus alvos (4.3). Se a placa foi congelada, descongele-a completamente (por exemplo, por incubação curta a 37 °C). Centrifugue a placa de 96 poços (5 min, 515 x g) e transfira cuidadosamente 100 μL do sobrenadante em cada poço para a placa ELISA pré-revestida e bloqueada.
nota: O sobrenadante deve ser coletado dos lados de cada poço para evitar a retirada das células.
- Se desejar, adicione mIL-2 recombinante com concentrações definidas a uma das fileiras vazias da placa ELISA revestida para gerar uma curva padrão de mIL-2. Por exemplo, comece com uma concentração de mIL-2 de 2.500 pg/mL e depois diminua em 50% em cada poço subsequente; não adicione mIL-2 ao último poço.
- Incubar a placa ELISA a 4 °C durante a noite ou a 37 °C durante 2 h.
- Lave a placa ELISA quatro vezes com PBS Tween.
- Adicione biotina anti-camundongo IL-2 à placa ELISA. Use uma concentração de 1 μg de anticorpo em 1 mL de 1x PBS com 1% de BSA e divida em 100 μL por poço.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave a placa ELISA seis vezes com PBS Tween.
- Adicione estreptavidina conjugada com HRP. Use uma concentração de 1 μL de estreptavidina em 1 mL de PBSX1 com 1% de BSA e divida-a em 100 μL por alvéolo.
- Incubar em temperatura ambiente por 30 min.
- Lave a placa ELISA seis vezes com PBS Tween.
- Adicionar 100 μL por alvéolo de solução de substrato TMB. Conclua esta etapa rapidamente para minimizar as diferenças entre os poços devido a atrasos ao adicionar o TMB.
- Ler a placa ELISA com um leitor de placas ELISA a 650 nm (a leitura pode ser repetida se o sinal for fraco).
