1. Isolamento de hemácias humanas, biotinilação e ajuste de osmolaridade
NOTA: A etapa 1.1 deve ser realizada por um profissional médico treinado, como uma enfermeira, com um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional.
- Obtenha 8-10 μl (uma gota) de sangue de uma picada no dedo e adicione-o a 1 ml do tampão carbonato/bicarbonato (Lista de materiais). Agite ou pipete suavemente a mistura e centrifugue por 1 min a 900 x g. Descarte o sobrenadante e lave mais uma vez.
- Em um béquer pequeno, pesar 3,5-4 mg de ligante Biotina-PEG3500-NHS (Lista de materiais). Dissolva-o no tampão carbonato/bicarbonato para perfazer a concentração final de 3 mg/ml.
- Misture 171 μl de tampão carbonato/bicarbonato, 10 μl de pacote de hemácias e 1049 μl de solução ligante de biotina-PEG3500-NHS e incube em RT por 30 min. Lave as hemácias uma vez com tampão carbonato/bicarbonato e depois duas vezes com tampão N2-5% (lista de materiais).
- Enquanto isso, coloque o frasco de ligação com uma tampa solta em um dessecador a vácuo de vidro cheio de dessecantes no fundo e aspire por 5 min e encha o dessecador com argônio. Aperte a tampa e retire a garrafa. Feche o frasco com filme plástico de parafina (Lista de materiais), coloque-o em um recipiente cheio de dessecantes no fundo e armazene-o a -20 °C.
nota: As etapas que envolvem o uso do ligante Biotina-PEG3500-NHS, incluindo 1.2-1.4 (exceto para incubação e lavagem em 1.3), precisam ser realizadas o mais rápido possível.
- Diluir a nistatina em tampão N2-5% para obter uma concentração final de 40 μg/ml. Misturar 5 μl de eritrócitos biotinilados com 71,4 μl de solução de nistatina (lista de materiais) e incubar durante 1 hora a 0 °C. Lavar duas vezes com tampão N2-5% e conservar com tampão N2-5% + BSA 0,5% (lista de materiais) no frigorífico (4 °C).
2. Silanização de esferas de vidro
- Limpeza da superfície do cordão
- Pesar 50 mg de pó de esferas de vidro e ressuspendê-las em 500 μl de água DI.
- Misturar 0,5 ml de H2O2 a 30% (lista de materiais) com 9,5 ml de água DI num copo de 50 ml, adicionar 2 ml de NH4OH concentrado (lista de materiais) e levar esta solução para uma caldeira sobre uma placa de aquecimento.
- Adicione as esferas de vidro à solução fervente e continue a ferver por mais 5 min. Agite suavemente a solução a cada min.
- Após a fervura, transferir ~5 ml desta suspensão de esferas quentes para um tubo de microcentrífuga de 15 ml e completar com água RT DI. Centrifugue a 3.500 x g por 5 min, remova e descarte o sobrenadante.
- Transfira mais 5 ml de suspensão de contas quentes e adicione às contas lavadas, complete com mais água DI, misture bem e centrifugue novamente. Repita este procedimento até que cerca de 50 ml de água DI sejam usados, o que será um total de 4 a 5 vezes a lavagem.
- Transfira a suspensão do grânulo para um frasco para injetáveis de 1 ml. Repita a lavagem dos grânulos com metanol (lista de materiais) por centrifugação a 17.000 x g por 5 min 3 vezes e, finalmente, ressuspenda os grânulos em 1 ml de metanol 100%.
- Tiolação da superfície do grânulo
- Em um tubo de centrífuga de 50 ml, adicione 45,6 ml de metanol, 0,4 ml de ácido acético (lista de materiais), 1,85 ml de água DI, 1,15 ml de 3-mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS) (lista de materiais) e 1 ml de suspensão de grânulos preparada em 2.1 e, em seguida, incube em RT por 3 horas.
- Após a reação, remova todos os reagentes lavando-os uma vez com metanol fresco e ressuspenda os grânulos em 500 μl de metanol. Divida uniformemente esta suspensão concentrada de esferas de vidro em um conjunto de 20 frascos de vidro secos e limpos com tampas de rosca. Evaporar o metanol usando um jato de argônio seco e girar lentamente os frascos de modo a formar uma fina camada de esferas secas nas laterais de cada frasco.
- Coloque os frascos de esferas em um forno de secagem pré-aquecido a 120 ° C por 5 min e, em seguida, retire e coloque rapidamente a (s) tampa (s) frouxamente (s). Coloque os frascos em um dessecador a vácuo de vidro cheio de dessecantes no fundo e aspire o dessecador com uma bomba de vácuo até esfriar.
- Purgue o dessecador aspirado com argônio seco para trazer o dessecador à pressão atmosférica normal. Remova a tampa do exsicador e reaperte rapidamente a(s) tampa(s) do frasco. Feche os frascos com filme plástico de parafina e guarde-os em RT em uma caixa de armazenamento escura e seca.
- Após o uso imediato, pegue um frasco para injetáveis de esferas secas e lave uma vez com tampão fosfato (lista de materiais), ressuspenda em 50 μl de tampão fosfato e armazene a 4 ° C. Essa preparação concentrada de esferas será chamada de "contas MPTMS" nas etapas a seguir.
nota: Com o armazenamento adequado, as contas MPTMS podem permanecer funcionais por até três meses.
3. Funcionalização do Bead
- Proteínas de revestimento covalente em grânulos
- Pegue um certo volume (por exemplo, 2,5 μl) do estoque de proteína e misture-o com um volume igual de tampão carbonato / bicarbonato para fazer a solução 1.
nota: O volume depende da concentração de estoque e da densidade final desejada da proteína na superfície dos grânulos.
- Num copo pequeno, pesar 2-3 mg de ligante MAL-PEG3500-NHS (lista de materiais) e dissolvê-lo com tampão carbonato/bicarbonato até atingir uma concentração final de 0,231 mg/ml.
- Misturar a solução 1 com um volume igual da solução ligante preparada em 3.1.2. Incube a mistura em RT por 30 min para fazer a Solução 2.
- Enquanto isso, coloque o frasco de ligação com uma tampa solta em um dessecador a vácuo de vidro cheio de dessecantes no fundo e aspire por 5 min e encha o dessecador com argônio. Aperte a tampa e retire a garrafa. Feche o frasco com filme plástico de parafina, coloque-o em um recipiente cheio de dessecantes no fundo e armazene a -20 °C.
nota: As etapas que envolvem o uso do ligante MAL-PEG3500-NHS, incluindo 3.1.2-3.1.4 (exceto para a incubação em 3.1.3), precisam ser realizadas o mais rápido possível.
- Misture 5 μl de esferas MPTMS com a Solução 2 e adicione tampão fosfato (lista de materiais) para fazer um volume final de 250 μl.
- Incubar as esferas durante a noite em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato e ressuspender em 100 μl de tampão fosfato e conservar a 4 °C.
- Preparação de grânulos revestidos de proteína/estreptavidina (SA)
- Siga o protocolo 3.1.1-3.1.4.
- Misturar 5 μl de esferas MPTMS com a solução 2 e 5 μl de solução de estreptavidina-maleimida (SA-MAL) (lista de materiais) a 4 mg/ml e, em seguida, adicionar tampão fosfato para perfazer um volume final de 250 μl.
- Incubar os grânulos durante a noite em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato e, finalmente, ressuspender em 100 μl de tampão fosfato e armazenar a 4 °C.
- Revestimento de estreptavidina em contas de vidro
- Misturar 5 μl de esferas de MPTMS com 5 μl de solução SA a 4 mg/ml e adicionar 140 μl de tampão fosfato.
- Incubar as esferas durante a noite em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato, ressuspender em 50 μl de tampão fosfato e conservar a 4 °C.
- Revestindo as esferas revestidas com SA com uma proteína biotinilada
- Misture 5 μl de esferas revestidas com SA com a proteína (volume dependendo da densidade de revestimento desejada) e adicione tampão fosfato para fazer o volume final ser de 100 μl.
- Incubar a mistura durante a noite a 4 °C ou durante 3 horas em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato e ressuspender em tampão fosfato a 50 μl e conservar a 4 °C.
4. Preparação da célula
NOTA: Para purificar as células, siga os protocolos padrão de purificação de células correspondentes ao tipo de células em uso, por ex.ample, células T ou certas linhagens celulares.
- Para experimentos de fBFP, uma vez que a suspensão celular é preparada, adicione Fura2-AM (lista de materiais) dissolvido em DMSO na suspensão celular para atingir uma concentração final de 2 μM, incube por 30 min em RT e depois lave uma vez. Mantenha esta suspensão de célula carregada com fluorescência no escuro até o uso.
5. Preparação para micropipetas e uma câmara celular
- Preparação de micropipetas
- Corte tubos de vidro capilar longos (lista de materiais) com um cortador de vidro em pedaços curtos de cerca de 3 polegadas de comprimento. Monte uma peça no extrator de micropipetas (Lista de materiais), clique no botão "Puxar" para que o meio do capilar seja aquecido pela máquina e o capilar seja puxado nas duas extremidades para fazer dois capilares com pontas afiadas (micropipetas cruas).
nota: Seguindo a diretriz do produto, a morfologia desejada da pipeta bruta tem um cone de 6-8 mm e uma ponta de 0,1-0,5 μm.
- Monte uma pipeta bruta no suporte da pipeta da forja de micropipetas (lista de materiais). Aqueça para derreter a esfera de vidro na forja. Insira a ponta da pipeta crua dentro da esfera de vidro. Resfrie a esfera de vidro e puxe a pipeta crua para quebrá-la por fora e deixar sua ponta dentro da esfera. Repita este procedimento até obter o orifício da ponta desejado.
nota: Exemplos de diâmetro interno da ponta de uma micropipeta: 2,0-2,4 μm para uma hemácia, ~ 1,5 μm para um cordão, ~ 2-4 μm para uma célula T e -7 μm para uma célula de hibridoma.
- Construindo uma Câmara Celular
NOTA: a câmara celular é construída com base em um suporte de câmara caseiro, que consiste em duas peças de quadrados de metal (cobre/alumínio) e uma alça que os une (Figura 1D).
- Corte uma lamínula de 40 mm x 22 mm x 0,2 mm usando um cortador de vidro em dois pedaços de 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (lamínulas 1 e 2). Cole a lamínula 1 com graxa na parte superior do suporte da câmara de forma que ela una os dois quadrados de metal e, da mesma forma, cole a lamínula 2 na parte inferior, que formará uma câmara de célula de lamínula paralela (Figura 1D).
- Utilizar uma pipeta para injectar 200 μl de tampão experimental entre as duas lamínulas. Certifique-se de que o buffer esteja conectado a ambas as lamínulas. Gire e agite suavemente a câmara para permitir que o tampão toque ambas as extremidades da câmara.
- Injete cuidadosamente óleo mineral em ambos os lados da câmara flanqueando a zona tampão experimental, selando assim o tampão ao ar livre. Injete suspensões de esferas de sonda (por exemplo, esferas revestidas com pMHC), hemácias e alvos (por exemplo, células T) nas regiões superior, média e inferior da zona tampão, respectivamente.
4. Experiência BFP
- Ligue o microscópio (Lista de materiais) e a fonte de luz. Coloque a câmara no microscópio principal stage(Figura 1A, D).
- Instale todas as três micropipetas de BFP (Figura 1D. Esquerda: sonda, para pegar uma hemácia, direita: alvo, para pegar uma célula ou conta, inferior direita: ajudante, para pegar uma conta).
- Use um microinjetor (lista de materiais) para preencher uma micropipeta com um tampão experimental. Retire o porta-pipetas (Lista de materiais) e segure-o em um local mais baixo para permitir que a água escorra da ponta. Insira rapidamente a micropipeta na ponta do suporte e certifique-se de que nenhuma bolha de ar entre na micropipeta durante a inserção. Aperte o parafuso de suporte.
- Monte cada porta-pipeta em seu micromanipulador correspondente. Empurre a micropipeta em direção à câmara para que suas pontas entrem na área tampão da câmara. Ajuste a posição da micropipeta e encontre-a sob o campo de visão do microscópio.
- Mova-se pelo estágio do suporte da câmara para encontrar as colônias de três elementos (os RBCs, os alvos e os grânulos da sonda) um por um. Ajuste a posição da micropipeta correspondente girando os botões dos manipuladores para permitir que a ponta da micropipeta se aproxime de uma célula/esfera. Aspire a célula/grânulo ajustando a pressão dentro da micropipeta correspondente. Todas as três micropipetas capturarão seus elementos correspondentes.
- Percorra o palco do suporte da câmara para encontrar um espaço aberto longe das colónias dos elementos injetados onde a experiência será realizada. Alterne o modo visual do microscópio para visualizar a imagem no programa de computador na tela do computador. Mova todos os três elementos nas ponteiras da pipeta para o campo de visão do programa.
- Alinhe o cordão da sonda e os eritrócitos e manobre cuidadosamente o cordão da sonda até o ápice do eritrócitos, colida brevemente com o cordão na eritrócitos e retraia suavemente. Ajuste a pressão da micropipeta auxiliar para soprar suavemente o cordão, de modo que fique colado no ápice das hemácias (Figura 1F). Afaste a micropipeta auxiliar e alinhe o alvo e o cordão da sonda (Figura 2A).
- No programa, na janela do campo de visão, use as ferramentas do programa para medir os respectivos raios da micropipeta da sonda (Rp), as hemácias (R0), a área de contato circular entre as hemácias e o cordão da sonda (Rc ), o que permite estimar a constante da mola das hemácias (k) pela seguinte equação, onde Δp é a pressão de aspiração na ponta da pipeta da sonda. Nota: Segue-se da lei de Hooke que a força de ligação, F, pode ser quantificada pelo produto da constante da mola e deslocamento do cordão da sonda (d), ou seja, F = d (Figura 2C).
- Insira a constante de mola RBC desejada no programa (consulte a seção 4.6 do protocolo. A constante da mola é normalmente definida em 0,25 ou 0,3 pN/nm para o ensaio de grampo de força e ensaio de frequência de adesão e 0,1 pN/nm para o ensaio de flutuação térmica), que retornará uma pressão de aspiração necessária na unidade de um centímetro de água. Ajuste a altura do tanque de água que se conecta à pipeta da sonda até que a pressão de aspiração necessária seja atingida.
- Desenhe uma linha horizontal no ápice RBC, que produzirá uma curva na janela adjacente indicando o brilho (valor da escala de cinza) de cada pixel ao longo desta linha. Arraste a linha de limite para ficar em torno da metade da profundidade da curva (Figura 2A, B).
nota: O ponto mínimo na curva de brilho abaixo da linha limite indica a posição do limite do cordão, portanto, apenas um mínimo local é permitido. Se dois ou mais mínimos locais estiverem no momento, isso indica que a imagem não é ideal (provavelmente devido à imagem estar fora de foco ou a um mau alinhamento entre o cordão da sonda e os eritrócitos).
- Selecione o modo de experimento desejado: ensaio de flutuação térmica, ensaio de frequência de adesão ou ensaio de grampo de força. Defina os parâmetros conforme desejado (por exemplo, força de impacto = 15 pN, taxa de carregamento = 1.000 pN/s, tempo de contato = 1 seg, força de fixação = 20 pN (para ensaio de pinça de força), etc.).
- Clique em "Iniciar", o que permite que o programa mova a pipeta alvo e conduza o alvo para dentro e para fora do contato com a sonda (consulte a seção Resultados representativos para obter detalhes). A coleta de dados será realizada em paralelo, registrando a posição do cordão da sonda em tempo real. Pare o programa clicando no botão "Parar experimento", momento em que uma janela aparecerá para permitir salvar os dados adquiridos.
