Sonda de força de biomembrana para quantificar as interações receptor-ligante

Resumo

Fonte: Chen, Y., et al., Sonda de Força de Biomembrana de Fluorescência: Quantificação Simultânea da Cinética do Receptor-Ligante e Sinalização Intracelular Induzida por Ligação em uma Única Célula. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, as sondas de força de biomembrana (BFPs) são usadas para medir as forças entre receptores e ligantes. Essa técnica pode detectar interações monitorando a pressão necessária para quebrar as ligações entre o pMHC conjugado nos grânulos da sonda e os TCRs nas células-alvo.

Protocolo

1. Isolamento de hemácias humanas, biotinilação e ajuste de osmolaridade

NOTA: A etapa 1.1 deve ser realizada por um profissional médico treinado, como uma enfermeira, com um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional.

1. Obtenha 8-10 μl (uma gota) de sangue de uma picada no dedo e adicione-o a 1 ml do tampão carbonato/bicarbonato (Lista de materiais). Agite ou pipete suavemente a mistura e centrifugue por 1 min a 900 x g. Descarte o sobrenadante e lave mais uma vez.
2. Em um béquer pequeno, pesar 3,5-4 mg de ligante Biotina-PEG3500-NHS (Lista de materiais). Dissolva-o no tampão carbonato/bicarbonato para perfazer a concentração final de 3 mg/ml.
3. Misture 171 μl de tampão carbonato/bicarbonato, 10 μl de pacote de hemácias e 1049 μl de solução ligante de biotina-PEG3500-NHS e incube em RT por 30 min. Lave as hemácias uma vez com tampão carbonato/bicarbonato e depois duas vezes com tampão N2-5% (lista de materiais).
4. Enquanto isso, coloque o frasco de ligação com uma tampa solta em um dessecador a vácuo de vidro cheio de dessecantes no fundo e aspire por 5 min e encha o dessecador com argônio. Aperte a tampa e retire a garrafa. Feche o frasco com filme plástico de parafina (Lista de materiais), coloque-o em um recipiente cheio de dessecantes no fundo e armazene-o a -20 °C.
   nota: As etapas que envolvem o uso do ligante Biotina-PEG3500-NHS, incluindo 1.2-1.4 (exceto para incubação e lavagem em 1.3), precisam ser realizadas o mais rápido possível.
5. Diluir a nistatina em tampão N2-5% para obter uma concentração final de 40 μg/ml. Misturar 5 μl de eritrócitos biotinilados com 71,4 μl de solução de nistatina (lista de materiais) e incubar durante 1 hora a 0 °C. Lavar duas vezes com tampão N2-5% e conservar com tampão N2-5% + BSA 0,5% (lista de materiais) no frigorífico (4 °C).

2. Silanização de esferas de vidro

1. Limpeza da superfície do cordão
   1. Pesar 50 mg de pó de esferas de vidro e ressuspendê-las em 500 μl de água DI.
   2. Misturar 0,5 ml de H₂O₂ a 30% (lista de materiais) com 9,5 ml de água DI num copo de 50 ml, adicionar 2 ml de NH₄OH concentrado (lista de materiais) e levar esta solução para uma caldeira sobre uma placa de aquecimento.
   3. Adicione as esferas de vidro à solução fervente e continue a ferver por mais 5 min. Agite suavemente a solução a cada min.
   4. Após a fervura, transferir ~5 ml desta suspensão de esferas quentes para um tubo de microcentrífuga de 15 ml e completar com água RT DI. Centrifugue a 3.500 x g por 5 min, remova e descarte o sobrenadante.
   5. Transfira mais 5 ml de suspensão de contas quentes e adicione às contas lavadas, complete com mais água DI, misture bem e centrifugue novamente. Repita este procedimento até que cerca de 50 ml de água DI sejam usados, o que será um total de 4 a 5 vezes a lavagem.
   6. Transfira a suspensão do grânulo para um frasco para injetáveis de 1 ml. Repita a lavagem dos grânulos com metanol (lista de materiais) por centrifugação a 17.000 x g por 5 min 3 vezes e, finalmente, ressuspenda os grânulos em 1 ml de metanol 100%.
2. Tiolação da superfície do grânulo
   1. Em um tubo de centrífuga de 50 ml, adicione 45,6 ml de metanol, 0,4 ml de ácido acético (lista de materiais), 1,85 ml de água DI, 1,15 ml de 3-mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS) (lista de materiais) e 1 ml de suspensão de grânulos preparada em 2.1 e, em seguida, incube em RT por 3 horas.
   2. Após a reação, remova todos os reagentes lavando-os uma vez com metanol fresco e ressuspenda os grânulos em 500 μl de metanol. Divida uniformemente esta suspensão concentrada de esferas de vidro em um conjunto de 20 frascos de vidro secos e limpos com tampas de rosca. Evaporar o metanol usando um jato de argônio seco e girar lentamente os frascos de modo a formar uma fina camada de esferas secas nas laterais de cada frasco.
   3. Coloque os frascos de esferas em um forno de secagem pré-aquecido a 120 ° C por 5 min e, em seguida, retire e coloque rapidamente a (s) tampa (s) frouxamente (s). Coloque os frascos em um dessecador a vácuo de vidro cheio de dessecantes no fundo e aspire o dessecador com uma bomba de vácuo até esfriar.
   4. Purgue o dessecador aspirado com argônio seco para trazer o dessecador à pressão atmosférica normal. Remova a tampa do exsicador e reaperte rapidamente a(s) tampa(s) do frasco. Feche os frascos com filme plástico de parafina e guarde-os em RT em uma caixa de armazenamento escura e seca.
   5. Após o uso imediato, pegue um frasco para injetáveis de esferas secas e lave uma vez com tampão fosfato (lista de materiais), ressuspenda em 50 μl de tampão fosfato e armazene a 4 ° C. Essa preparação concentrada de esferas será chamada de "contas MPTMS" nas etapas a seguir.
      nota: Com o armazenamento adequado, as contas MPTMS podem permanecer funcionais por até três meses.

3. Funcionalização do Bead

1. Proteínas de revestimento covalente em grânulos
   1. Pegue um certo volume (por exemplo, 2,5 μl) do estoque de proteína e misture-o com um volume igual de tampão carbonato / bicarbonato para fazer a solução 1.
      nota: O volume depende da concentração de estoque e da densidade final desejada da proteína na superfície dos grânulos.
   2. Num copo pequeno, pesar 2-3 mg de ligante MAL-PEG3500-NHS (lista de materiais) e dissolvê-lo com tampão carbonato/bicarbonato até atingir uma concentração final de 0,231 mg/ml.
   3. Misturar a solução 1 com um volume igual da solução ligante preparada em 3.1.2. Incube a mistura em RT por 30 min para fazer a Solução 2.
   4. Enquanto isso, coloque o frasco de ligação com uma tampa solta em um dessecador a vácuo de vidro cheio de dessecantes no fundo e aspire por 5 min e encha o dessecador com argônio. Aperte a tampa e retire a garrafa. Feche o frasco com filme plástico de parafina, coloque-o em um recipiente cheio de dessecantes no fundo e armazene a -20 °C.
      nota: As etapas que envolvem o uso do ligante MAL-PEG3500-NHS, incluindo 3.1.2-3.1.4 (exceto para a incubação em 3.1.3), precisam ser realizadas o mais rápido possível.
   5. Misture 5 μl de esferas MPTMS com a Solução 2 e adicione tampão fosfato (lista de materiais) para fazer um volume final de 250 μl.
   6. Incubar as esferas durante a noite em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato e ressuspender em 100 μl de tampão fosfato e conservar a 4 °C.
2. Preparação de grânulos revestidos de proteína/estreptavidina (SA)
   1. Siga o protocolo 3.1.1-3.1.4.
   2. Misturar 5 μl de esferas MPTMS com a solução 2 e 5 μl de solução de estreptavidina-maleimida (SA-MAL) (lista de materiais) a 4 mg/ml e, em seguida, adicionar tampão fosfato para perfazer um volume final de 250 μl.
   3. Incubar os grânulos durante a noite em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato e, finalmente, ressuspender em 100 μl de tampão fosfato e armazenar a 4 °C.
3. Revestimento de estreptavidina em contas de vidro
   1. Misturar 5 μl de esferas de MPTMS com 5 μl de solução SA a 4 mg/ml e adicionar 140 μl de tampão fosfato.
   2. Incubar as esferas durante a noite em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato, ressuspender em 50 μl de tampão fosfato e conservar a 4 °C.
4. Revestindo as esferas revestidas com SA com uma proteína biotinilada
   1. Misture 5 μl de esferas revestidas com SA com a proteína (volume dependendo da densidade de revestimento desejada) e adicione tampão fosfato para fazer o volume final ser de 100 μl.
   2. Incubar a mistura durante a noite a 4 °C ou durante 3 horas em RT, lavar 3 vezes com tampão fosfato e ressuspender em tampão fosfato a 50 μl e conservar a 4 °C.

4. Preparação da célula

NOTA: Para purificar as células, siga os protocolos padrão de purificação de células correspondentes ao tipo de células em uso, por ex.ample, células T ou certas linhagens celulares.

1. Para experimentos de fBFP, uma vez que a suspensão celular é preparada, adicione Fura2-AM (lista de materiais) dissolvido em DMSO na suspensão celular para atingir uma concentração final de 2 μM, incube por 30 min em RT e depois lave uma vez. Mantenha esta suspensão de célula carregada com fluorescência no escuro até o uso.

5. Preparação para micropipetas e uma câmara celular

1. Preparação de micropipetas
   1. Corte tubos de vidro capilar longos (lista de materiais) com um cortador de vidro em pedaços curtos de cerca de 3 polegadas de comprimento. Monte uma peça no extrator de micropipetas (Lista de materiais), clique no botão "Puxar" para que o meio do capilar seja aquecido pela máquina e o capilar seja puxado nas duas extremidades para fazer dois capilares com pontas afiadas (micropipetas cruas).
      nota: Seguindo a diretriz do produto, a morfologia desejada da pipeta bruta tem um cone de 6-8 mm e uma ponta de 0,1-0,5 μm.
   2. Monte uma pipeta bruta no suporte da pipeta da forja de micropipetas (lista de materiais). Aqueça para derreter a esfera de vidro na forja. Insira a ponta da pipeta crua dentro da esfera de vidro. Resfrie a esfera de vidro e puxe a pipeta crua para quebrá-la por fora e deixar sua ponta dentro da esfera. Repita este procedimento até obter o orifício da ponta desejado.
      nota: Exemplos de diâmetro interno da ponta de uma micropipeta: 2,0-2,4 μm para uma hemácia, ~ 1,5 μm para um cordão, ~ 2-4 μm para uma célula T e -7 μm para uma célula de hibridoma.
2. Construindo uma Câmara Celular
   NOTA: a câmara celular é construída com base em um suporte de câmara caseiro, que consiste em duas peças de quadrados de metal (cobre/alumínio) e uma alça que os une (Figura 1D).
3. Corte uma lamínula de 40 mm x 22 mm x 0,2 mm usando um cortador de vidro em dois pedaços de 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (lamínulas 1 e 2). Cole a lamínula 1 com graxa na parte superior do suporte da câmara de forma que ela una os dois quadrados de metal e, da mesma forma, cole a lamínula 2 na parte inferior, que formará uma câmara de célula de lamínula paralela (Figura 1D).
4. Utilizar uma pipeta para injectar 200 μl de tampão experimental entre as duas lamínulas. Certifique-se de que o buffer esteja conectado a ambas as lamínulas. Gire e agite suavemente a câmara para permitir que o tampão toque ambas as extremidades da câmara.
5. Injete cuidadosamente óleo mineral em ambos os lados da câmara flanqueando a zona tampão experimental, selando assim o tampão ao ar livre. Injete suspensões de esferas de sonda (por exemplo, esferas revestidas com pMHC), hemácias e alvos (por exemplo, células T) nas regiões superior, média e inferior da zona tampão, respectivamente.

4. Experiência BFP

1. Ligue o microscópio (Lista de materiais) e a fonte de luz. Coloque a câmara no microscópio principal stage(Figura 1A, D).
2. Instale todas as três micropipetas de BFP (Figura 1D. Esquerda: sonda, para pegar uma hemácia, direita: alvo, para pegar uma célula ou conta, inferior direita: ajudante, para pegar uma conta).
   1. Use um microinjetor (lista de materiais) para preencher uma micropipeta com um tampão experimental. Retire o porta-pipetas (Lista de materiais) e segure-o em um local mais baixo para permitir que a água escorra da ponta. Insira rapidamente a micropipeta na ponta do suporte e certifique-se de que nenhuma bolha de ar entre na micropipeta durante a inserção. Aperte o parafuso de suporte.
   2. Monte cada porta-pipeta em seu micromanipulador correspondente. Empurre a micropipeta em direção à câmara para que suas pontas entrem na área tampão da câmara. Ajuste a posição da micropipeta e encontre-a sob o campo de visão do microscópio.
3. Mova-se pelo estágio do suporte da câmara para encontrar as colônias de três elementos (os RBCs, os alvos e os grânulos da sonda) um por um. Ajuste a posição da micropipeta correspondente girando os botões dos manipuladores para permitir que a ponta da micropipeta se aproxime de uma célula/esfera. Aspire a célula/grânulo ajustando a pressão dentro da micropipeta correspondente. Todas as três micropipetas capturarão seus elementos correspondentes.
4. Percorra o palco do suporte da câmara para encontrar um espaço aberto longe das colónias dos elementos injetados onde a experiência será realizada. Alterne o modo visual do microscópio para visualizar a imagem no programa de computador na tela do computador. Mova todos os três elementos nas ponteiras da pipeta para o campo de visão do programa.
5. Alinhe o cordão da sonda e os eritrócitos e manobre cuidadosamente o cordão da sonda até o ápice do eritrócitos, colida brevemente com o cordão na eritrócitos e retraia suavemente. Ajuste a pressão da micropipeta auxiliar para soprar suavemente o cordão, de modo que fique colado no ápice das hemácias (Figura 1F). Afaste a micropipeta auxiliar e alinhe o alvo e o cordão da sonda (Figura 2A).
6. No programa, na janela do campo de visão, use as ferramentas do programa para medir os respectivos raios da micropipeta da sonda (Rp), as hemácias (R0), a área de contato circular entre as hemácias e o cordão da sonda (Rc ), o que permite estimar a constante da mola das hemácias (k) pela seguinte equação, onde Δp é a pressão de aspiração na ponta da pipeta da sonda. Nota: Segue-se da lei de Hooke que a força de ligação, F, pode ser quantificada pelo produto da constante da mola e deslocamento do cordão da sonda (d), ou seja, F = d (Figura 2C).
   
7. Insira a constante de mola RBC desejada no programa (consulte a seção 4.6 do protocolo. A constante da mola é normalmente definida em 0,25 ou 0,3 pN/nm para o ensaio de grampo de força e ensaio de frequência de adesão e 0,1 pN/nm para o ensaio de flutuação térmica), que retornará uma pressão de aspiração necessária na unidade de um centímetro de água. Ajuste a altura do tanque de água que se conecta à pipeta da sonda até que a pressão de aspiração necessária seja atingida.
8. Desenhe uma linha horizontal no ápice RBC, que produzirá uma curva na janela adjacente indicando o brilho (valor da escala de cinza) de cada pixel ao longo desta linha. Arraste a linha de limite para ficar em torno da metade da profundidade da curva (Figura 2A, B).
   nota: O ponto mínimo na curva de brilho abaixo da linha limite indica a posição do limite do cordão, portanto, apenas um mínimo local é permitido. Se dois ou mais mínimos locais estiverem no momento, isso indica que a imagem não é ideal (provavelmente devido à imagem estar fora de foco ou a um mau alinhamento entre o cordão da sonda e os eritrócitos).
9. Selecione o modo de experimento desejado: ensaio de flutuação térmica, ensaio de frequência de adesão ou ensaio de grampo de força. Defina os parâmetros conforme desejado (por exemplo, força de impacto = 15 pN, taxa de carregamento = 1.000 pN/s, tempo de contato = 1 seg, força de fixação = 20 pN (para ensaio de pinça de força), etc.).
   1. Clique em "Iniciar", o que permite que o programa mova a pipeta alvo e conduza o alvo para dentro e para fora do contato com a sonda (consulte a seção Resultados representativos para obter detalhes). A coleta de dados será realizada em paralelo, registrando a posição do cordão da sonda em tempo real. Pare o programa clicando no botão "Parar experimento", momento em que uma janela aparecerá para permitir salvar os dados adquiridos.

Resultados

Figura 1: montagem do fBFP.

(A) Uma imagem geral do sistema de hardware fBFP. (B) Um desenho esquemático do sistema de hardware fBFP. (C) O sistema de câmera dupla "DC2" (laranja) no qual a câmera de alta velocidade (azul) e uma câmera de fluorescência (branca) foram montadas. (D) O estágio de microscópio...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparação do tampão fosfato
Anhy. Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparação do tampão fosfato
Carbonato de sódio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparação de tampão de carbonato/bicarbonato
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparação de tampão de carbonato/bicarbonato
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	N2-5% de preparação de tampão
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	Pág. 9541	N2-5% de preparação de tampão
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	Pág. 5655	N2-5% de preparação de tampão
sacarose	Sigma-Aldrich	S0389	N2-5% de preparação de tampão
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funcionalização do cordão
Biotina-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	Biotinilação de hemácias
Nistatina	Sigma-Aldrich	N6261	Ajuste de osmolaridade de hemácias
Hidróxido de amônio (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Silanização de esferas de vidro
metanol	BDH	67-56-1	Silanização de esferas de vidro
30% de peróxido de hidrogênio (H2O2)	J. T. Barker	Janeiro de 86	Silanização de esferas de vidro
Ácido acético (glacial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Silanização de esferas de vidro
3-Mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS)	Uct Especialidades, llc	Rolamento 4420-74-0	Funcionalização de esferas de vidro
Grânulos de vidro borossilicato	Tecnologia de partículas Distrilab	Rolamento 9002	Funcionalização de esferas de vidro
Streptavidin-Maleimide	Sigma-Aldrich	S9415	Funcionalização de esferas de vidro
Bsa	Sigma-Aldrich	A0336	Funcionalização do ligante
Fura2-AM	Tecnologias da Vida	F-1201	Carga de corante de fluorescência de cálcio intracelular
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Carga de corante de fluorescência de cálcio intracelular
Grânulos de PE Quantibrite	BD Biociências	340495	Quantificação de densidade
Tubo capilar 0,7-1,0 mm x 30 polegadas	Perseguição de Kimble	Rolamento 46485-1	Fabricação de micropipetas
Extrator de micropipeta flamejante/marrom	instrumento sutter	Pág. 97	Fabricação de micropipetas
Narishige	Narishige	Narishige	Fabricação de micropipetas
Óleo mineral	Fisher Científico	BP2629-1	Montagem da câmara
Vidro de cobertura do microscópio	Fisher Científico	12-544-G	Montagem da câmara
Micro-injetor	Instrumentos de precisão mundiais	MF34G-5	Montagem da câmara
Seringa de 1 ml	Bd	309602	Montagem da câmara
Porta-micropipetas	Narishige	HI-7	Montagem da câmara
Microscópio (TiE invertido)	Nikon	MEA53100	Sistema BFP
Plano CFI Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	Sistema BFP
Câmera, GE680, 640 x 480, GigE, CCD de 1/3", mono	Graftek Imaging	02-2020C	Sistema BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, ADC de 12 bits	Graftek Imaging	02-2185A	Sistema BFP
Cabeça de sonda submicrônica manual com controle remoto de alta resolução	Karl Suss	PH400	Sistema BFP
Mesa antivibração (5' x 3')	TMC	77049089	Sistema BFP
Estágio de translação manual 3D	Newport	462-XYZ-M
Software CAD 3D SolidWorks	Software CAD 3D SolidWorks	Versão 2012 SP5	Sistema BFP
Software LabVIEW	Instrumentos nacionais	Versão 2009	Sistema BFP, programa BFP
Estágio translacional piezo 3D	Instrumento Físico	M-105.3P	Sistema BFP
Acumulador piezo linear	Instrumento Físico	P-753.1CD	Sistema BFP
Tampão carbonato/bicarbonato (pH 8,5)			8,4 g/L de carbonato de sódio (Na2CO3), 10,6 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3)
Tampão N2-5% (pH 7,2)			27,6 g/L de NaFosfato monobásico (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibásico (Na2HPO4)
			20,77 g/L de cloreto de potássio (KCl), 2,38 g/L de cloreto de sódio (NaCl), 0,13 g/L de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), 0,71 g/L de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4), 9,70 g/L de sacarose