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1. Purificação de GTPase marcada com GST
- Cultura de uma estirpe de E. coli, como BL21, transformada com pGEX-Rac1 O/N a 37 °C, agitando a 220 rpm, em 500 ml de meios de autoindução (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5% de Glicerol, 0,05% de Glicose, 0,2% de Lactose, 5 g de Triptona, 2,5 g de Extrato de Levedura, 100 μg/ml de Ampicilina).
- Colha bactérias por centrifugação por 10 min a 10.000 x g, 4 °C.
- Ressuspenda o pellet bacteriano em 20 ml de reagente de extração de proteína, 1x inibidor de protease e incube por 20 min em RT com inversão.
- Clarificar o lisado por centrifugação a 40.000 x g durante 30 min.
- Adicione 2 ml de grânulos magnéticos de glutationa, lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS: 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Incubar durante 2 horas, misturando por inversão a 4 °C.
- Lave as esferas carregadas de proteínas quatro vezes com 10 ml de PBS, usando um classificador de partículas magnéticas para precipitar as esferas em cada etapa.
- Ressuspenda os grânulos carregados de proteínas em 2 ml de PBS e conserve a -80 °C em alíquotas de 100 μl até que seja necessário.
2. Expressão de proteínas de ligação à GTPase
- No dia anterior ao experimento, os plasmídeos transfectos que codificam as versões marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) de cada proteína de ligação à GTPase em um frasco separado de 75 cm2 de HEK293T da seguinte forma. Para validação do carregamento de nucleotídeos, transfecte o TrioD1 marcado com GFP em um terceiro frasco de 75 cm2 de HEK293T.
- Diluir a polietilamina a 1 mg/ml em 100 μl de NaCl estéril a 150 mM.
- Adicione 27 μl de polietilamina diluída a 223 μl de meio de soro reduzido.
- Adicionar 12 μg de ADN plasmidial a 250 μl de meio sérico reduzido.
- Incube cada tubo por 2 min em RT.
- Combine as misturas de polietilamina e DNA em um único tubo e vórtice por 2 min.
- Incube por 15-20 min em RT.
- Substitua o meio de crescimento (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, sem antibióticos) em HEK293T confluente a 90% por 5 ml de meio de crescimento fresco.
- Adicionar a mistura combinada polietilamina/ADN ao balão e incubar O/N a 37 °C, 5% de CO2.
3. Purificação de proteínas de ligação à GTPase
- Enxágue os frascos de células transfectadas em PBS e drene o frasco por 5 min, aspirando líquido livre.
- Raspe as células em tampão de lise de 500 μl (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inibidor de protease) em um tubo de microcentrífuga.
- Lise as células misturando por inversão a 4 °C durante 30 min.
- Durante a lise, lave dois lotes de grânulos GFP-Trap de 40 μl três vezes com tampão de lise fresco, sedimentando os grânulos a 2.700 x g por 2 min entre as lavagens.
- Clarificar os lisados por centrifugação a 21.000 x g durante 10 min.
- Transferir lisado clarificado de cada uma das proteínas concorrentes para separar as esferas de armadilha GFP lavadas e permitir que as proteínas de fusão GFP se liguem durante 2 horas, misturando por inversão a 4 °C. Manter o lisado das células GFP-TrioD1 em gelo.
- Lave os grânulos GFP-Trap carregados duas vezes em 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (p / v) Nonidet P-40 e duas vezes em 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2, sedimentando grânulos a 2.700 x g por 2 min entre as lavagens.
- Eluir proteínas de fusão GFP adicionando 40 μl de glicina 0,2 M (pH 2,5) e pipetando para cima e para baixo por 30 segundos. Sedimente imediatamente os grânulos a 21.000 x g por 60 s e transfira o líquido para um novo tubo de microcentrífuga contendo 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Faça isso rapidamente para limitar os danos à proteína purificada.
- Analise 1 μl de cada proteína purificada por Western blot e teste com um anticorpo anti-GFP para estabelecer o rendimento relativo usando um sistema de blotting quantitativo de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, determine as concentrações de proteínas pelo ensaio de ácido bicinconínico (BCA), mas isso introduz erros se as proteínas não reagirem com o ensaio de maneira idêntica ou se houver proteínas contaminantes.
- Equalize a concentração de proteína molar pela adição de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) e 20 mM de MgCl2.
4. Carregamento de nucleotídeos da GTPase
- Descongele uma alíquota de grânulos magnéticos GST-Rac1, preparados na etapa 1.
- Pegue 90 μl de grânulos GST-Rac1 e lave três vezes com 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT e 4 mM EDTA, usando um classificador de partículas magnéticas para precipitar os grânulos em cada etapa.
- Aspire o tampão dos grânulos e adicione 100 μl de Tris-HCl 20 mM (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM e EDTA 4 mM.
- De acordo com a necessidade de GDP, GTP ou nenhuma carga de nucleotídeo para o experimento de competição, adicione 12 μl de 100 mM de GDP, 12 μl de 10 mM de guanosina 5'-[γ-tio]trifosfato (GTPγS) ou nenhum nucleotídeo a 60 μl de grânulos de GST-Rac1
.
- Para os controles de carregamento de nucleotídeos, divida os grânulos restantes em três alíquotas de 10 μl e adicione 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS ou nenhum nucleotídeo a cada tubo.
- Incubar misturas de esferas por 30 min a 30 °C com agitação.
- Estabilize o Rac1 ligado a nucleotídeos pela adição de 1 M MgCl2: 3 μl à mistura experimental (etapa 4.4) e 0,5 μl a cada uma das misturas de controle (etapa 4.5).
5. Vinculação do concurso
- Configure 6 tubos de microcentrífugas, cada um contendo:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl de grânulos Rac1 experimentais carregados com nucleotídeos (da etapa 4.7)
5 μl de proteína A de ligação a Rac1 (proteína de ligação constante)
- A cada tubo, adicione 0, 1, 2,5, 5, 10 ou 20 μl de proteína B de ligação a Rac1 (proteína de ligação variável). Esses volumes assumem concentrações de estoque aproximadamente iguais das proteínas de ligação constantes e variáveis e podem precisar ser ajustados.
- Ajustar os volumes das proteínas de ligação A e B se existirem grandes diferenças nas afinidades de ligação das duas proteínas e isso deve ser determinado empiricamente através das repetições experimentais. Completar o volume total da mistura de ligação a 235 μl pela adição de 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) e 20 mM de MgCl2.
- Configure um tubo de microfuga contendo:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl de grânulos Rac1 experimentais carregados com nucleotídeos (da etapa 4.7)
10 μl de proteína A de ligação a Rac1 (proteína de ligação constante)
- Configure os tubos de controle GDP, GTPγS e sem nucleotídeos:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
Grânulos de controle Rac1 de 10 μl carregados na etapa 4.5 com GDP, GTPγS ou nenhum nucleotídeo e estabilizados na etapa 4.7.
180 μl HEK293T lisado GFP-TrioD1, preparado como na etapa 3.6
4 μl 1 M MgCl2
- Incubar a mistura durante 2 horas, misturando por inversão a 4 °C.
- Lave as esferas três vezes com 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6) e 20 mM de MgCl2.
- Proteínas ligadas à eluíte em 20 μl de tampão de amostra redutor (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% de glicerol, 0,02 mg / ml de azul de bromofenol, 5% de β-mercaptoetanol).