Ensaio de microarranjo de antígeno viral para detectar isotipos de anticorpos no soro contra o antígeno viral

Resumo

Fonte: Khan, S., et al., Uso de um microarray de antígeno influenza para medir a amplitude de anticorpos séricos em subtipos de vírus. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos o processo de detecção de isotipos de anticorpos em várias amostras de soro humano usando uma lâmina de microarray impressa com subtipos antigênicos de cepas do vírus influenza.

Protocolo

1. Produza microarrays de antígenos de influenza

1. Imprima antígenos em lâminas de microarray
   1. Reconstitua cada antígeno liofilizado a uma concentração de 0,1 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,001% de Tween-20 (T-PBS). Transferir 10 μL de cada antígeno reconstituído para alvéolos individuais de uma placa de fundo plano de 384 poços não tratada.
   2. Imprima antígenos usando uma impressora de microarray com pinos de detecção de microarray de baixo volume que aspiram o antígeno no canal da amostra e depositam por contato direto e ação capilar em lâminas de vidro revestidas de nitrocelulose de 16 almofadas.
      1. Programe o software de impressão (por exemplo, Gridder) com a configuração da placa de origem e os parâmetros de impressão.
         1. Use o menu suspenso para selecionar o nome do tipo de chapa que será usado com este método de impressão. Para este estudo, use uma placa de fundo plano de 384 poços não tratada.
         2. Selecione a caixa de texto ao lado de Número de chapas e digite o número de chapas de amostra que serão usadas neste protocolo de impressão. Para este estudo, use 1 placa.
         3. Selecione uma configuração de pino para usar com este método. Para este estudo, use uma configuração de 8 pinos.
         4. Certifique-se de que os deslocamentos de origem sejam as distâncias (nas direções X e Y) entre a origem do slide (que é calibrada na seção Administrativa) e o local onde os pinos de impressão começarão a ser impressos nos slides.
         5. Usando a guia Design de matriz, defina o tamanho e a forma das matrizes (espaçamento de pontos e o número de pontos por submatriz). Para este estudo, imprima 324 pontos (180 μm de diâmetro com espaçamento de 300 μm) em lâminas de 16 blocos em formato 18x18 usando 8 pinos.
         6. Selecione os parâmetros de como os pinos de impressão coletam e dispensam amostras. Para este estudo, cada pino aspira 250 nL de solução de antígeno e imprime 1 nL em cada um dos 40 pontos (total de 20 lâminas para todos os 8 pinos)
         7. Configure o protocolo de limpeza de pinos e o protocolo de borrão. Para este estudo, cada antígeno de impressão de pino é mergulhado em ddH₂O estéril em recipiente de lavagem sonicado e, em seguida, aspira o próximo antígeno.
         8. Defina a sequência na qual os blocos de amostra são impressos nos slides. O software de array construirá um arquivo de índice de grade anotado (.gal) para descrever o arranjo de antígenos dentro de cada microarray.
            nota: A linha superior é usada para fiduciais (com fluorescência em todos os comprimentos de onda usados em imagens, por exemplo, uma mistura de conjugado de estreptavidina Qdot 585 nm e conjugado de estreptavidina Qdot 800 nm neste estudo) para orientar as grades durante a imagem. Para longas tiragens de impressão, os antígenos na placa de origem podem ser periodicamente ressuspensos pipetando para cima e para baixo e depois centrifugando, ou uma nova placa de origem pode ser preparada e usada.
   3. Coloque as lâminas de microarray não sondadas em uma caixa à prova de luz e mantenha-as em um gabinete dessecador em temperatura ambiente para armazenamento de longo prazo.
      nota: O protocolo pode ser pausado indefinidamente neste momento.
2. Realizar verificação de controle de qualidade (requer etiquetas de poli-histidina)
   1. Encaixe a lâmina nas câmaras de sondagem e reidrateie com um tampão de bloqueio, conforme descrito nas etapas 2.1.1-2.1.2 e mostrado na Figura 1.
   2. Dilua o anticorpo monoclonal poli-His de camundongo 1:100 em 1x tampão de bloqueio filtrado.
      nota: Se antígenos proteicos não purificados (por exemplo, expressos no sistema de transcrição e tradução in vitro) forem usados diretamente para imprimir microarrays, adicione componentes do sistema de expressão de proteínas (por exemplo, lisado de E. coli) na proporção de 1:10 com o tampão de bloqueio usado para diluição do soro, a fim de bloquear quaisquer anticorpos direcionados contra esses componentes.
   3. Adicionar 100 μL de anticorpo poli-His diluído a cada câmara de lâminas que contenha a almofada de matriz após aspiração e incubar durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C num agitador. Lave 3x com tampão T-TBS conforme descrito na etapa 2.2.1. Dilua o anticorpo secundário IgG de cabra conjugado com biotina 1:200 em tampão de bloqueio, adicione 100 μL por poço após a aspiração e incube por 1 h em temperatura ambiente em um agitador. Lave 3x com tampão T-TBS.
   4. Diluir o conjugado de estreptavidina Qdot 585 nm a 4 nM no tampão de bloqueio, adicionar 100 μL por alvéolo após a aspiração e incubar durante 1 h à temperatura ambiente no agitador. Lave 3x com tampão T-TBS e, em seguida, uma vez com tampão TBS (sem interpolação).
   5. Desmontar e quantificar as lâminas conforme descrito nas etapas 2.2.5 – 3.1.2.
      nota: Os antígenos proteicos devem conter tags His10 para usar este protocolo de controle de qualidade. Alternativamente, se uma etiqueta diferente for incluída, uma verificação de controle de qualidade pode ser realizada com um anticorpo ou ligante para essa etiqueta.

2. Soros de sonda para anticorpos contra influenza usando microarrays

1. Incube soros em microarrays para ligação de anticorpos.
   1. Prenda as lâminas de microarray às câmaras usando clipes e coloque-as em quadros, conforme mostrado na Figura 2.
      nota: Sempre evite tocar na almofada do microarray com as mãos e instrumentos. Certifique-se de que os slides estejam orientados com o lado da almofada para cima e o pequeno entalhe no canto superior direito.
   2. Reidrate as lâminas de microarray com 100 μL por poço de tampão de bloqueio 1x filtrado e dilua o soro 1:100 em 100 μL de tampão de bloqueio (pode usar placas de 96 poços não tratadas ou tubos de 2 mL). Incubar lâminas de microarranjo reidratadas em estruturas cobertas e soros diluídos separadamente por 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100-250 rpm. Execute todas as etapas de incubação subsequentes de forma semelhante no agitador.
      nota: Os soros devem ser alíquotados e congelados a -80 °C para armazenamento a longo prazo para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento e devem ser submetidos a vórtices para misturar e centrifugados para remover partículas antes do uso. Observe as câmaras deslizantes cuidadosamente durante e após esta etapa para detectar qualquer vazamento que exija a remontagem das câmaras deslizantes.
   3. Usando pontas de pipeta conectadas a uma linha de vácuo com um frasco de coleta secundário, aspire cuidadosamente o tampão de bloqueio do canto de cada câmara sem tocar nas almofadas. Execute todas as etapas de aspiração subsequentes da mesma forma. Adicione soros diluídos aos absorventes rapidamente após a aspiração para não permitir que sequem.
   4. Coloque as molduras cobertas em bandejas dentro de um recipiente secundário cercado por toalhas de papel úmidas e lacrado para evitar a evaporação. Incubar durante a noite a 4 °C em um agitador de balanço (alternativamente, pode incubar por 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100-250 rpm).
2. Anticorpos séricos ligados ao rótulo com anticorpos secundários conjugados com pontos quânticos
   1. Aspire os soros das câmaras cuidadosamente conforme descrito acima, adicione 100 μL por poço de tampão T-TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 em ddH₂O ajustado para pH 7,5 e filtrado, pode ser obtido comercialmente) e incube por 5 min em um agitador orbital a 100-250 rpm. Repita esta etapa de lavagem um total de 3x (todas as etapas de lavagem subsequentes são executadas de forma semelhante).
   2. Prepare uma mistura de anticorpos secundários diluídos a 1 μM em tampão de bloqueio e misture bem pipetando antes e durante o uso para manter a homogeneidade.
      nota: Para manter a reprodutibilidade do ensaio, o mesmo lote de cada anticorpo secundário deve ser usado para todos os experimentos de sondagem para os quais a comparação quantitativa de dados entre experimentos está planejada. A concentração específica de anticorpo secundário pode precisar ser variada dependendo da afinidade; Siga os protocolos do fabricante sempre que disponíveis.
   3. Aspirar o tampão das câmaras após a lavagem final, adicionar 100 μL por alvéolo de mistura de anticorpos secundários e incubar durante 2 h à temperatura ambiente num agitador.
   4. Aspire a mistura de anticorpos secundários, lave 3x com tampão T-TBS e, em seguida, lave uma vez com tampão TBS (sem Tween).
   5. Desmonte as lâminas de microarray das câmaras com cuidado para evitar tocar nas almofadas, enxágue suavemente com ddH₂O filtrado e seque-as colocando-as em tubos de 50 mL e centrifugando a 500 x g por 10 min.
   6. Coloque as lâminas de microarray sondadas em uma caixa à prova de luz e mantenha-as em um gabinete dessecador em temperatura ambiente para armazenamento de longo prazo.
      nota: O protocolo pode ser pausado por até 1 semana neste momento.

3. Quantifique a ligação de anticorpos a antígenos dentro do microarray

1. Visualize lâminas de microarray e quantifique a intensidade da fluorescência pontual para medir a ligação de anticorpos.
   1. Adquira imagens de lâminas de microarray usando o gerador de imagens portátil com software integrado.
      1. Na guia Configurar Gerador de Imagens, selecione a configuração de slide adequada. Para este estudo, use slides de 16 almofadas.
      2. No separador Controlo de imagem, selecione o canal fluorescente adequado e ajuste o ganho, o tempo de exposição e o tempo de aquisição em função da reatividade do soro para obter imagens ideais. Para este estudo, os canais fluorescentes para IgA e IgG foram 585 nm e 800 nm, respectivamente, e as configurações de imagem foram ganho de 50, tempo de exposição de 500 ms e tempo de aquisição de 1 s.
      3. Clique em Capturar para iniciar o processo de aquisição da imagem.
         nota: As lâminas de microarray podem ser recriadas em várias configurações sem degradação dos sinais, desde que sejam armazenadas escuras e secas. Outros sistemas de imagem podem ser usados se compatíveis com as lâminas.
2. Detecte pontos de matriz usando grades orientadas com base nos marcadores fiduciais e meça a intensidade do ponto como a mediana da intensidade do pixel menos o fundo medido ao redor dos pontos. Execute este algoritmo de quantificação em lote usando o software de imagem integrado, que utiliza o arquivo .gal construído na etapa 1.1.2 para conectar intensidades pontuais a antígenos individuais em cada microarray.
   1. No painel Informações do arquivo, carregue o arquivo .gal selecionando em sua pasta no computador e especifique a pasta onde os arquivos de saída da análise devem ser salvos na seção Opções de análise.
   2. Na guia Controle de imagem, abra uma das imagens adquiridas a serem quantificadas e selecione o botão Auto no canto superior direito.
   3. Na seção Análise de Matriz no canto inferior direito, crie um modelo fiducial conforme as instruções do software.
   4. Clique na Análise em Lote, selecione a pasta que contém as imagens a serem quantificadas e selecione o modelo fiducial que foi criado na etapa anterior. O software analisa cada imagem e quantifica a intensidade do ponto.
      nota: Esta etapa gerará um arquivo .csv contendo intensidades pontuais quantificando anticorpos dentro de cada amostra de soro que se ligam a cada antígeno individual no microarray que pode ser posteriormente manipulado em software de manipulação ou análise de planilhas.
3. Analise dados brutos para comparar a ligação de anticorpos entre antígenos e amostras de soro. Para este estudo, os anticorpos IgA e IgG medidos como intensidades de pontos fluorescentes de 585 nm e 800 nm foram comparados em todos os antígenos entre 2 execuções independentes do experimento usando lâminas diferentes em dias diferentes, e a análise de correlação foi realizada para medir a reprodutibilidade do ensaio.
   nota: Para proteínas não purificadas impressas como mistura de expressão, a análise de dados deve começar com a subtração de fundo de nenhum controle de DNA.

Resultados

Figura 1: Esquema do protocolo de impressão e sondagem de microarray de antígeno influenza. Da esquerda para a direita, o microarray é impresso usando lâminas revestidas de nitrocelulose, que são usadas para sondar soros para anticorpos IgG e IgA usando anticorpos secundários conjugados com pontos quânticos, com lâminas fotografadas usando um gerador de imagens portátil e resultados ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16 almofadas de lâminas de vidro revestidas de nitrocelulose	Grace Bio Labs	305016
1x buffer de bloqueio GVS FAST	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam gerador de imagens portátil	Grace Bio Labs	400S	Outros dispositivos de imagem podem ser usados para visualizar lâminas se forem capazes de atingir a resolução dos pontos de microarray e os comprimentos de onda de excitação e emissão dos pontos quânticos.
anticorpo anti-IgG de cabra conjugado com biotina	Thermo Fischer	31800
HiBase Placa de 384 poços	Greiner Bio-One	T-3037-11
Pinos de microarray	ArrayIt	GMP2	Cada impressora de microarray diferente pode exigir seus próprios pinos de microarray personalizados.
Anticorpo monoclonal poli-His de camundongo	Sigma-Aldrich	H1029
Impressora de microarray OmniGrid 100	GeneMachines		A versão da impressora de microarray utilizada neste trabalho não está mais disponível comercialmente, mas o equipamento similar atualizado é a impressora de microarray OmniGrid Accent da Digilab (Hopkinton, MA), e o mesmo protocolo pode ser realizado com a maioria das impressoras de microarray disponíveis comercialmente.
ProPlate	Grace Bio Labs	246890
Clipes de slides ProPlate	Grace Bio Labs	204838
ProPlate quadros de slides	Grace Bio Labs	246879
Quantum dot 585 nm anticorpo anti-IgA de cabra conjugado	Grace Bio Labs	110620
Ponto quântico 585 nm conjugado de estreptavidina	Thermo Fischer	Q10111MP
Quantum dot 800 nm anticorpo anti-IgG de cabra conjugado	Grace Bio Labs	110610