Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento de monócitos humanos primários por seleção imunomagnética negativa
- Colete 40 mL de sangue total humano fresco (de um paciente HIV+ ou controle saudável) em quatro tubos de vácuo de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de 10 mL (10 mL de sangue por tubo). Usando técnicas estéreis sob um gabinete de biossegurança, transfira todos os 40 mL de sangue para um tubo cônico de propileno de 50 mL.
- Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de isolamento de monócitos humanos selecionado (Tabela de Materiais), adicione 2 mL de coquetel de isolamento de monócitos, fornecido no kit, ao tubo de sangue. Grânulos magnéticos de vórtice, também fornecidos no kit, por 30 s, e adicione 2 mL ao tubo de sangue.
- Se menos de 40 mL de sangue estiverem disponíveis, reduza os reagentes adicionados. Para misturar a solução, pipete para cima e para baixo com uma pipeta sorológica plástica de 25 mL e incube por 5 min em temperatura ambiente (RT).
- Separe a mistura de sangue igualmente em quatro tubos de 50 mL e adicione 30 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 mM de EDTA a cada tubo. Misturar pipetando para cima e para baixo com uma pipeta serológica de plástico de 25 ml.
- Coloque os tubos em suportes magnéticos por 10 min para remover os grânulos magnéticos conjugados com anticorpos. Use quatro suportes magnéticos simultaneamente, um para cada tubo, para permitir tempos consistentes de incubação e isolamento para cada amostra de sangue.
- Retire o conteúdo do centro de cada tubo, usando uma pipeta, enquanto eles ainda estão nos suportes magnéticos. Tenha cuidado para não extrair glóbulos vermelhos (não mais do que 10% do volume inicial de 10 mL) e coloque o conteúdo em um dos quatro novos tubos de 50 mL.
- Adicione 500 μL de esferas magnéticas com vórtice a cada tubo de 50 mL. Pipete para cima e para baixo com uma pipeta de 25 mL e incube em RT por 5 min. Em seguida, coloque os tubos em suportes magnéticos por 5 min.
- Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo enquanto ainda estiver nos suportes magnéticos para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Coloque diretamente cada novo tubo de 50 mL nos suportes magnéticos por 5 min.
- Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Gire todos os novos tubos de 50 mL a 300 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda todos os quatro pellets celulares em um total de 10 mL de PBS estéril.
- Contagem de células por exclusão de azul de tripano usando um hemocitômetro.
NOTA: 8-20 x 106 células são geralmente obtidas a partir de 40 mL de sangue total.
2. Cultura de monócitos humanos primários
- Usando um banho-maria a 37 ° C, meio RPMI 1640 quente sem soro suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina (caneta / estreptococo) e (continuando a usar técnicas estéreis sob um gabinete de biossegurança) ressuspenda os monócitos isolados neste meio a uma concentração de 1 x 106 células / mL.
- Adicionar 1 ml de células ressuspensas a cada alvéolo de uma placa de 6 poços ou a uma placa de 35 mm (o número final de células deve ser 1 x 106 células/placa) e colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Aguarde 0,5-1,0 h para que as células adiram.
- Usando um banho-maria a 37 °C, soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (HI) quente. Adicione 100 μL (concentração final de 10%) de FBS a cada placa. Adicione fatores de crescimento às células para promover a diferenciação dos macrófagos.
- Prepare macrófagos para um fenótipo semelhante a M1 adicionando 25 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ao meio. Principais macrófagos para um fenótipo semelhante ao M2 adicionando 50 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) ao meio.
nota: Tanto o GM-CSF quanto o M-CSF permitem a diferenciação de monócitos para um fenótipo geral de macrófagos (M0) enquanto preparam as células para M1 ou M2, respectivamente.
