Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento e cultivo de PMC por lavagem intraperitoneal
- Isolamento de PMC por lavagem intraperitoneal
- Antes do isolamento celular, prepare os materiais listados na Tabela 1.
- Use camundongos machos de 8 a 14 semanas para isolamento de PMC. Eutanásia de um camundongo por inalação de CO2 e confirme a morte por perda de reflexos. Pulverize o mouse com etanol 70% e fixe-o em um bloco de espuma usando pinos (lado dorsal para baixo). Remova a pele ventral do mouse usando uma tesoura de ponta romba. Evite danificar a cavidade peritoneal.
nota: Usamos normalmente este protocolo para camundongos com um fundo genético da cepa C57BL / 6N.
- Injetar 7 ml do meio RPMI gelado e 5 ml de ar na cavidade peritoneal utilizando uma seringa de 10 ml equipada com uma agulha de 27 G. Empurre a agulha com cuidado no peritônio e não perfure nenhum órgão. Use um ponto na região da gordura do epidídimo para reduzir o risco de perfuração do órgão.
- Após a injeção, agite o mouse por 1 min para separar as células peritoneais no meio RPMI. Não agite o mouse com muita força, para evitar danificar os órgãos internos e contaminar a cavidade peritoneal com o sangue.
- Reutilize a seringa de 10 mL equipando-a com uma nova cânula de 20 G. Desloque os órgãos internos para um lado inclinando o bloco de espuma e batendo-o suavemente no banco para facilitar a aspiração média do outro lado. Insira uma agulha de 20 G, incline e aspire o fluido do abdômen suave e lentamente (~ 0,5 mL / s) para evitar o entupimento dos órgãos internos. Colete o máximo de líquido possível (normalmente 5-6 mL).
- Remova a agulha da seringa e transfira a suspensão celular coletada para um tubo de coleta no gelo. Descarte um sample tubo se houver contaminação visível do sangue.
- Centrifugue os tubos com a suspensão da célula a ~ 300 x g por 5 min. Sob um capuz estéril, aspire o sobrenadante. Para cada ratinho, combinar os sedimentos da amostra em 4 ml de meio PMC frio (4-10 °C) e transferir a suspensão celular para um balão de culturade 25 cm 2. Adicione os fatores de crescimento IL-3 e SCF às concentrações finais de 10 ng/mL e 30 ng/mL, respectivamente. Colocar o balão contendo as células numa incubadora (37 °C e 5% de CO2) e incubar durante ~48 h até ao procedimento seguinte.
- Cultura PMC
- Dia 2 (~48 h após o isolamento): Mudança média
- Para remover as células sobrenadantes e não aderentes (eritrócitos e células mortas), aspirar o meio do balão colocando uma ponta de pipeta de Pasteur na borda do frasco e segurando o frasco quase horizontalmente. Adicione 4 mL de PMC Medium pré-aquecido por mouse. Adicione os fatores de crescimento IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL). Colocar o balão que contém as células numa estufa (37 °C e 5% de CO2).
- Dia 9: Divisão celular
- Transferir a suspensão celular do balão de cultura para um tubo de centrifugação de plástico de 50 ml. Lavar o balão três vezes com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (37 °C) pré-aquecida (37 °C), recolhendo a suspensão celular com as células destacadas no mesmo tubo de centrifugação de plástico de 50 ml. Conte a concentração celular por um hemocitômetro e calcule o número total de células.
- Centrifugue a suspensão celular a ~ 300 x g por 5 min e aspire o sobrenadante. Recupere o pellet em meio PMC pré-aquecido (37 °C) para obter a concentração celular de 1 x 106 células/mL. Transferir a suspensão celular para um novo balão de 25 cm2 para culturas. Descarte o frasco velho com fibroblastos aderidos ao fundo.
- Adicione os fatores de crescimento IL-3 (10 ng/ml) e SCF (30 ng/ml) e coloque o balão contendo as células numa estufa (37 °C e 5% de CO2).
- Dias 12 a 15: Medições de células
- Se algum experimento com estimulação dos receptores FcɛRI for planejado, pré-trate as células durante a noite com 300 ng/mL de IgE anti-DNP em um meio de cultura padrão.
2. Medição da liberação de beta-hexosaminidase em PMCs
- Antes das medições, prepare os materiais listados na Tabela 2.
NOTA: A β-hexosaminidase liberada dos MCs após sua estimulação hidrolisa a p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) em p-nitrofenol e N-acetil-D-glucosamina. A quantidade de β-hexosaminidase na amostra é proporcional à quantidade de p-nitrofenol que será formada. Em um ambiente de alto pH de "Stop Solution", o p-nitrofenol existe como p-nitrofenolato totalmente desprotonado e pode ser detectado por sua absorbância de luz a 405 nm.
- Prepare a solução de Tyrode contendo 130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,4 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 5,6 mM de glicose e BSA 0,1%. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH 3 M.
- Prepare a solução de lise adicionando um volume de 1% de Triton X-100 à solução de Tyrode.
- Preparar a solução de paragem composta por 200 mM de glicina e ajustar o pH para 10,7 com NaOH.
- Prepare a solução de pNAG (4-nitrofenil 2-acetamido-2-desoxi-β-D-glicopiranosídeo) dissolvendo o pNAG em ácido cítrico 0,4 M até uma concentração final de 4 mM.
- Calcule a quantidade de células necessárias para o ensaio (execute o ensaio em duplicado). Use 200.000 PMCs por poço. Use 2 poços como controles negativos (solução de Tyrode sem secretagogos, como DNP ou composto 48/80) e 2 poços como controles positivos (solução de Tyrode com 10 μM de ionomicina) para cada genótipo.
- Transfira as células para um tubo de centrífuga de plástico de 15 mL, ajuste o volume para 15 mL com a solução de Tyrode e centrifugue a 200 x g por 4 min. Remova o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e ressuspenda as células na solução de Tyrode para 2 x 106 células / mL.
- Transfira 100 μL da suspensão de células por poço para uma placa de poço de fundo em V de 96 poços. Adicione 25 μL de solução de estimulação ou controle a cada poço (de acordo com o esquema de pipetagem ilustrado na Figura 1A). Incubar as células durante 45 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Pare a reação colocando a placa de 96 poços no gelo por 5 min. Em seguida, centrifugue a placa a 4 °C durante 4 min a 120 x g. Transfira 120 μL do sobrenadante usando uma pipeta multicanal para uma placa de fundo plano de 96 poços e coloque-a no gelo. Evite cuidadosamente tocar nos grânulos celulares, mas aspire completamente o sobrenadante.
- Adicione 125 μL de tampão de lise aos pellets celulares. Incube os grânulos celulares por 5 min à temperatura ambiente e ressuspenda-os após a incubação por pipetagem repetida (aproximadamente 5 vezes).
- Pipetar 25 μL da solução de pNAG (4 mM) nos poços necessários de uma nova placa de fundo plano de 96 poços. Adicione 25 μL de cada sobrenadante à solução de pNAG preparada, bem como 25 μL de cada lisado celular.
- Incubar os lotes de reacção durante 1 h a 37 °C. Após a incubação, pipetar 150 μL de solução de parada para cada poço para interromper a reação.
- Analise a placa com um leitor de microplacas usando uma configuração de comprimento de onda duplo a 405 nm com referência 630 nm para subtração automática do fundo. No programa de aquisição, marque a caixa "Referência" e no menu do elemento do programa "Absorbância", selecione "630 nm" na lista suspensa. Se a densidade óptica das amostras for demasiado elevada, preparar uma diluição adequada da sonda antes de voltar a medir.
Tabela 1: Materiais para a Etapa 1.
| 1 | gelo |
| algarismo | Seringas de 10 mL |
| 3 | Agulhas de 27 g |
| 4 | Agulhas de 20 g |
| 5 | Bloco e pinos de isopor |
| 6 | Tubos de coleta (tubos de centrífuga de plástico de 50 mL) |
| 7 | 70% de etanol |
| 8 | RPMI Médio (Pré resfriado e mantido no gelo) |
| 9 | Meio PMC: Meio RPMI + 20% FCS (soro fetal de bezerro) + solução de penicilina estreptomicina a 1% (Pen-Strep) |
| 10 | Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco - DPBS (sem Ca2+ e Mg2+) |
| 11 | Frascos de Cultura (25 cm) |
| 12 | Soluções estoque de fatores de crescimento (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipetas sorológicas (10 mL) |
| 14 | Pontas de pipetas estéreis (20–200 μL) |
| 15 | Hemocitômetro |
| 16 | Centrífuga de bancada |
| 17 | Tesouras e pinças |
| 18 | Câmara de CO2 para camundongos |
| 19 | Capuz estéril aberto |
| 20 | Capuz estéril fechado |
| 21 | Incubadora de células (37 °C e 5% de CO2) |
| 22 | Pipetas de transferência (20–200 μL) |
Tabela 2: Materiais para a Etapa 2.
| 1 | PMC (12 a 15 dias de idade) 1 x 106 células/mL |
| algarismo | Solução estoque de anticorpo anti-DNP (IgE) |
| 3 | Solução de estoque DNP-HSA |
| 4 | Solução-mãe composta 48/80 |
| 5 | Ionomicina |
| 6 | Placa de 96 poços, fundo em forma de V |
| 7 | Placas de 96 poços, fundo plano |
| 8 | Tubos de centrífuga de plástico (15 mL) |
| 9 | Pipetas sorológicas |
| 10 | Incubadora de células (37 °C e 5% de CO2) |
| 11 | Centrífuga de bancada |
| 12 | Leitor de placas microtituladas para medições de densidade óptica |
| 13 | Pipeta multicanal (20–200 μL) |
| 14 | Hemocitômetro |
