Isolamento e cultura de células de Kupffer de camundongo

Resumo

Fonte: Bourgognon, M., et al. Isolamento de células de Kupffer para testes de toxicidade de nanopartículas. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células de Kupffer ou macrófagos hepáticos do fígado de camundongo. O fígado é perfundido com uma solução de digestão seguida de separação por gradiente de densidade. As células de Kupffer aderentes isoladas podem ser usadas para análises posteriores.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Perfusão e coleta de células (Figura 1)

1. Preparar de novo todos os reagentes descritos no quadro de materiais.
2. Aqueça a solução EGTA (ácido etilenoglicol tetra-acético) / HBSS (solução salina balanceada de Hank) (50 ml por camundongo) e a solução de colagenase (100 ml por camundongo) por 30 min a 40 ° C.
3. Enxágue primeiro o tubo flexível da bomba com etanol a 70%. Despeje 40 ml de solução EGTA/HBSS em um tubo de centrífuga imerso no banho-maria e enxágue o tubo flexível da bomba com solução EGTA/HBSS pré-aquecida.
4. Realize anestesia terminal usando um barbitúrico para produzir inconsciência de forma confiável antes da depressão respiratória e da morte. Injetar fenobarbitona a 1 mg/kg, i.p. num ratinho CD1 fêmea ou macho (35-45 g). Confirme a anestesia beliscando o dedo do pé.
5. Raspe os pelos abdominais e esterilize a superfície abdominal usando uma solução de etanol a 70%.
6. Corte a cavidade abdominal e exponha a veia porta e a veia cava inferior movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdômen.
7. Iniciar a bomba a uma velocidade de 1-3 ml/min com a solução EGTA/HBSS e canular a veia porta com uma agulha borboleta de 23 g (corte das asas). Clamp a seção da veia porta canulada com a agulha 23 G e, em seguida, vire a pinça serrefine na superfície do abdômen aberto do camundongo. O fígado deve palidar rapidamente nos primeiros 30 segundos de perfusão da solução EGTA/HBSS.
8. Incijar rapidamente a parte inferior da veia cava inferior para evitar o acúmulo de pressão excessiva no fígado e, em seguida, aumentar a taxa de fluxo gradualmente para 7 ml/min, durante o primeiro minuto de perfusão. O animal morre devido a sangramento secundário à punção venosa da veia cava.
9. Quando restarem menos de 5 ml de solução de EGTA/HBSS no tubo de centrifugação, encha-o com solução de colagenase (40-50 ml). Aumentar gradualmente o caudal para 10 ml/min, durante 30 segundos.
10. Faça o fígado inchar aplicando pressão na veia cava inferior, usando uma pinça, por intervalos de 5 a 10 segundos. Isso pode ser feito periodicamente (5 a 10 vezes durante a digestão). Esta etapa melhorará a dissociação das células hepáticas e reduzirá o tempo de perfusão com colagenase.
11. Quando menos de 10 ml de solução de colagenase permanecerem dentro do tubo da centrífuga, despeje 40-50 ml de solução de colagenase pré-aquecida no tubo da centrífuga.
12. Após 10-15 min de perfusão e cerca de 70-80 ml de solução de colagenase perfundida, aplique uma pequena pressão na superfície do fígado com uma pinça. Uma impressão da pressão indica que as células do fígado estão dissociadas.
13. Remova o fígado da cavidade abdominal inteiro e coloque-o em um tubo de centrífuga contendo 20-30 ml de meio de isolamento de células de Kupffer. Mantenha as células hepáticas congeladas ou a 4 °C por um período máximo de 3 horas para evitar afetar a viabilidade das células hepáticas.
14. Repita o procedimento de perfusão em vários animais, se necessário, mantendo o fígado perfundido no gelo. Reúna de um a três fígados para purificação e prossiga com o estágio 3.

2. Preparação do gradiente de densidade para centrifugação (Figura 2)

1. Prossiga com as etapas a seguir (seções 2, 3 e 5) em condições estéreis e mantenha as células congeladas ou a 4 ° C. Prepare o SIP (Solução de Partículas de Sílica Revestidas Isotônicas) misturando 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestida com 1,7 ml de 10 x PBS.
2. Para fazer 20 ml de solução SIP a 25%, misture 5 ml de SIP com 15 ml de PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP a 50%, misture 10 ml de SIP com 10 ml de PBS.
3. Encha um tubo de centrífuga com 20 ml da solução SIP a 50%. Incline o tubo de centrífuga em um ângulo próximo a 90° e adicione lentamente a solução SIP a 25% (20 ml) na parede lateral do tubo usando uma pipeta sorológica de 25 ml, sem tocar a superfície da camada SIP a 50%. Ao adicionar a solução SIP a 25%, reduza progressivamente o ângulo do tubo. Mantenha o gradiente de densidade no gelo até o uso.

3. Purificação de células de Kupffer (Figura 3)

1. Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 ml de meio de isolamento de células de Kupffer. Romper a cápsula de Glisson (membrana do fígado) com uma tesoura e libertar todas as células do fígado para o meio de isolamento de células de Kupffer. Filtrar a solução através de um filtro de células de 100 μm para ser recolhido num tubo de centrifugação. Repita o procedimento de perfusão em fígados perfundidos adicionais e agrupe as células no mesmo tubo de centrífuga (15 ml de um camundongo e até 45 ml de três camundongos).
2. Centrifugue a suspensão celular a 50 x g por 2 min a 4 °C. As células parenquimatosas (hepatócitos) estarão no pellet e as células não parenquimatosas (incluindo as células de Kupffer) estarão no sobrenadante.
3. Recolha o sobrenadante num tubo de centrifugação limpo e centrifugue a 50 x g durante 2 min cada. Repita esta etapa mais três vezes.
4. Centrifugue a 1.350 x g por 15 min para pellet células não parenquimatosas. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de Kupffer Cell Isolation Medium.
5. Adicionar a solução de células não parenquimatosas ao gradiente isotónico descontínuo de 25/50%, conforme descrito em 2.3. Centrifugue a 850 x g por 15 min sem aceleração ou quebra.
6. Localize a fração de células de Kupffer enriquecida que aparece turva dentro da fração SIP de 25% perto da interface SIP de 25/50% (Figura 3). Com uma pipeta serológica de 10 ml, aspirar cerca de 12 ml da fracção enriquecida de células de Kupffer. Transfira as células para um tubo de centrífuga contendo 35-40 ml de meio de isolamento de células de Kupffer. Misturar delicadamente e centrifugar a 1.350 x g durante 15 min a 4 °C para granular as células.
7. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 5-10 ml de meio de cultura de células de Kupffer pré-aquecido. Conte as células (hemocitômetro) e meça a viabilidade usando a coloração com azul de tripano.
8. Coloque as células não parenquimatosas purificadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10⁵ células/poço. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂ (Figura 3). Após 30 min, remova suavemente o meio, lave com solução salina balanceada de Hank (HBSS) pré-aquecida uma vez e substitua-o por 500 μl de meio de cultura de células Kupffer fresco e pré-aquecido (por poço).

Resultados

Figura 1: Perfusão hepática. Após a anestesia do camundongo, o trato digestivo é movido lateralmente para a esquerda do abdômen, a fim de tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulado usando uma taxa de fluxo lenta (1-3 ml/min) de solução EGTA/HBSS e a veia cava inferior (VCI) é imediatamente rompida para evitar qualquer excesso de pressão no fígado. No primeiro minuto de perfusão, a taxa de fl...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Euthatal (pentobarbital sódico)	Merial
Camundongos CD1	Rio Charles	-	O peso do mouse deve variar de 35 a 45 g. Aconselhamos o uso de camundongos CD1 machos, pois seu peso aumenta rapidamente (por exemplo, um camundongo CD1 macho de 7 semanas de idade excede 35 g de peso). Também é aconselhável entrar em contato com o fornecedor de animais com antecedência para providenciar a entrega de animais mais velhos. Alternativamente, os animais podem ser internos para atingir o peso desejado.
HBSS (livre de Ca2+ e Mg2+, com bicarbonato)	Tecnologias da Vida	14175-053	O HBSS deve ser livre de Ca2+.
Sal tetrassódico de ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E8145	O EDTA também pode ser usado, mas o EGTA tem a vantagem de quelar Ca2+ seletivamente.
HEPES (1M)	Tecnologias da Vida	Rolamento 15630-056	100 ml
Colagenase tipo IV	Worthington	CSL-4	É aconselhável testar diferentes lotes de colagenase ou pelo menos mencionar ao fornecedor que o produto deve ser adequado para o isolamento das células hepáticas
DMEM de baixa glicose	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (com piruvato de sódio e Glutamax®)	Tecnologias da Vida	Rolamento 12633-012	500 ml
Penicilina/Steptomicina	Tecnologias da Vida	15140-122	100 ml
Soro fetal bovino	Primeiro link	60-00-850	500 ml
Solução de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Solução de partículas de sílica revestida (Percoll®)	GE Cuidados de Saúde	17-0891-02	Percoll® é muito estável e pode ser mantido por vários anos
1x solução salina tamponada com fosfato	Tecnologias da Vida	10010-023	500 ml
10x solução salina tamponada com fosfato	Tecnologias da Vida	70011-036	500 ml
Conjunto de coleta de sangue de borboleta (tubo de 23G / 305 mm de comprimento)	Bd	367288
Filtros de seringa (0,22 μm de borda azul)	Minisart	16534-K
Tubos de centrífuga (tampa azul de 50 ml)	BD Biociências, Falcon	35 2070
Placa de Petri (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Científico	BSN 101VR20
Filtro de células de 100 μm	Bd	Rolamento 352360
Bomba peristáltica	Watson Marlow	SciQ 300	Enxágue o tubo antes e depois de cada uso com PBS estéril e etanol a 70%.
Placas de 24 poços	Corning	3526
centrifuga	Eppendorf	5810R
Pinça Serrefine	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	A pinça serrefine permite pinçar o vaso canulado com a agulha 23G sem a necessidade de segurar a pinça durante o procedimento de perfusão. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Raspador de células	BD Biociências, Falcon	353086	Corte as extremidades da lâmina com uma tesoura para raspar as células em placas de 24 poços.
Solução EGTA (ácido etilenoglicol tetracético)/HBSS (solução salina balanceada de Hank)			HBSS contendo 0,5 mM EGTA e 25 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,4. Prepare 50 ml para cada fígado perfundir.
Solução de colagenase			DMEM baixa glicose contendo colagenase tipo IV a 100 UI/ml, HEPES 15 mM e Penicllin/Estreptamicina a 1% (v/v). Ajuste o pH para 7,4. Prepare 100 ml para cada fígado perfundir. Após a adição da colagenase, é aconselhável aquecer a solução por 30 min antes do uso. Isso permite que a atividade da colagenase seja ótima.
Meio de isolamento de células de Kupffer			RPMI contendo 1% de aminoácidos não essenciais (v/v), 1% de glutamax® (v/v) e 1% de penicllin/estreptomicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.
Meio de cultura celular Kupffer			RPMI contendo 10% de soro bovino fetal, 1% de aminoácidos não essenciais (v/v), 1% de glutamamax® (v/v) e 1% de penicllina/estreptamicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.
SIP (solução de partículas de sílica revestidas isotônicas)			Misture 1,7 ml de solução salina tamponada com fosfato 10x com 15,3 ml de Percoll® para obter 17mL de SIP.
Solução SIP a 25%			Misture 5 ml de SIP com 15 ml de 1x solução salina tamponada com fosfato
Solução SIP a 50%			Misture 10 ml de SIP com 10 ml de 1x solução salina tamponada com fosfato
Tampão de lise			Mídia DMEM com 0,9% Triton X-100
Solução PBS/BSA			Prepare solução salina tamponada com fosfato fresco pH 7,4 com albumina de soro bovino a 1%.