Diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em macrófagos

Resumo

Fonte: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Produção e Caracterização de Macrófagos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo descreve um método in vitro para gerar macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). A geração de macrófagos a partir de iPSCs ocorre em três estágios: (i) agregação de iPSCs em suspensão para formar corpos embrióides tridimensionais (EBs) que se diferenciam em células mesodérmicas, (ii) formação de células precursoras de macrófagos a partir de EBs diferenciados e (iii) diferenciação das células precursoras de macrófagos em macrófagos maduros e funcionais.

Protocolo

1. Diferenciação de iPSC humana para macrófagos

NOTA: Um resumo esquemático do protocolo de diferenciação de macrófagos é representado na Figura 1.

1. Preparação de diferenciação celular, fatores de crescimento e outros reagentes
   1. Preparar meios livres de soro de células-tronco embrionárias humanas (hESC-SFM; ver Tabela de Materiais) suplementando o meio Eagle modificado de Dulbecco-F12 (DMEM/F12) com suplemento de hESC, albumina sérica bovina (BSA) a 1,8% p/v e 2-mercaptoetanol 0,1 mM.
   2. Prepare uma solução de gelatina suína a 0,1% p/v, dissolvendo-a em água estéril. A solução de gelatina pode ser armazenada a 4 °C por até 2 anos.
   3. Preparar a solução-mãe de proteína morfogenética óssea humana (BMP4) (25 μg/ml) dissolvendo a BMP4 numa solução de cloreto de hidrogénio (HCl)-0,2% BSA PBS a 4 mM. Distribuir a solução-mãe em alíquotas de 50 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C por até 1 ano. Depois de descongelado, o estoque BMP4 pode ser armazenado a 4 °C por 5 dias.
   4. Prepare a solução estoque de fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF) (100 μg / mL) dissolvendo o VEGF em uma solução de BSA PBS a 0,2%. Distribuir a solução-mãe sob a forma de alíquotas de 10 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C por até 1 ano. Depois de descongelado, o estoque de VEGF pode ser armazenado a 4 °C por 7 dias.
   5. Prepare a solução-mãe do fator de células-tronco humanas (SCF) (100 μg/mL) dissolvendo o SCF em uma solução de BSA PBS a 0,2%. Distribuir a solução-mãe sob a forma de alíquotas de 5 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C por até 1 ano. Depois de descongelado, o SCF de estoque pode ser armazenado a 4 °C por 10 dias.
   6. Prepare a solução estoque de interleucina-3 humana (IL3) (10 μg / mL) dissolvendo IL3 em uma solução de BSA PBS a 0,2%. Distribuir a solução-mãe sob a forma de alíquotas de 500 μL em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C por até 2 anos. Uma vez descongelado, o estoque de IL3 pode ser armazenado a 4 °C por 15 dias.
   7. Prepare a solução-mãe do fator estimulador de colônias de macrófagos humanos (CSF1) (10 μg / mL) dissolvendo o CSF1 em uma solução de BSA PBS a 0,2%. Distribuir a solução-mãe sob a forma de alíquotas de 1 ml em criotubos. As soluções de estoque podem ser armazenadas a -20 °C por até 2 anos. Uma vez descongelado, o estoque CSF1 pode ser armazenado a 4 °C por 15 dias.
2. Estágio 1: Geração de corpos embrióides (dia 0 – dia 3)
   1. No dia 0, adicione 2,25 mL de meio de Estágio 1 (hESC-SFM suplementado com 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF e 20 ng/mL SCF) em dois poços de placas de 6 poços de fixação ultrabaixa.
   2. Substitua o meio de manutenção de um poço confluente de 80% de iPSCs em uma placa de 6 poços por 1.5 mL de meio de Stage 1.
   3. Corte as colônias usando a ferramenta de passagem de células e transfira as colônias cortadas com uma pipeta para os dois poços de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa (consulte a Tabela de Materiais).
   4. No dia 2, leve as citocinas a uma concentração final de 50 ng/mL de BMP4, 50 ng/mL de VEGF e 20 ng/mL de SCF usando 0,5 mL de meio hESC-SFM.
      nota: As colônias IPSC se tornarão EBs (Figura 2A).
3. Estágio 2: Emergência de células hematopoiéticas em suspensão
   1. No dia 4, cubra 4 poços de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços com gelatina a 0,1% p/v e incube por pelo menos 10 min.
   2. Remova a gelatina e adicione 2,5 mL de meio de estágio 2 (X-VIVO15 suplementado com 100 ng/mL de CSF1, 25 ng/mL de IL-3, 2 mM de glutamax, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,055 mM de 2-mercaptoetanol).
   3. Colete EBs formados em um tubo de centrífuga de 50 mL e deixe-os assentar no fundo do tubo por gravidade. Aspire cuidadosamente a mídia.
   4. Ressuspenda EBs em 2 mL de meio de Stage 2.
   5. Transfira 10–15 EBs (não mais que 15) para um poço revestido de gelatina contendo 2,5 mL de meio Stage 2.
   6. Incubar EBs a 37 °C e 5% de CO₂ ar.
   7. Troque a mídia em EBs revestidos a cada 3 a 4 dias por 2 a 3 semanas.
   8. Após 2 a 3 semanas, os EBs começam a liberar células hematopoiéticas não aderentes em suspensão.
      nota: Este período de liberação de células em suspensão pode variar e depende da linhagem celular. As células desta suspensão podem ser colhidas e amadurecidas em macrófagos (ver Estágio 3) (Figura 2A).
4. Estágio 3: Maturação terminal de macrófagos
   1. Colete células hematopoiéticas em suspensão e reabasteça o meio (meio do estágio 2) na placa EB.
   2. Centrifugue as células em suspensão a 200 x g durante 3 min.
   3. Ressuspenda as células em suspensão no meio do Estágio 3 (X-VIVO15 suplementado com 100 ng/mL de CSF1, 2 mM de glutamax e 1% de penicilina-estreptomicina).
   4. A placa coletou e girou as células em placas de plástico não tratado de grau bacteriológico de 10 cm (10 mL) ou placas de cultura de tecidos de 6 poços não revestidas (3 mL) com densidade de 0,2 x 10⁶ células/mL.
   5. Mantenha as células na mídia do Estágio 3 por 9 a 11 dias, trocando a mídia a cada 5 dias.
      nota: As etapas 1.4.1–1.4.5 do Estágio 3 podem ser repetidas a cada 3–4 dias e as células em suspensão podem ser colhidas da placa EB original por até 3 meses.

Resultados

Figura 1: Resumo gráfico da diferenciação de iPSC para macrófagos funcionais maduros. Diagrama desenhado com Biorender.

Figura 2: Diferenciação de iPSC em relação a macrófagos e número e morfologia de iPSC-DM. (A) Imagens de campo clar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CellMask Mancha de membrana plasmática vermelha profunda	Thermofisher	C10046	Meios de criopreservação
Criostor CS10	sigma	C2874
CTS CELLstart Substrato	Invitrogen	A1014201	Substrato de células-tronco
Gelatina de pele suína	sigma	G9136
Proteína BMP4 humana recombinante	R&d	314-BP-010
IL3 humana recombinante	Pré-tecnologia	0200-03-10
MCSF humano recombinante (sem transportadora) 100ug	Biolenda	574806
Proteína VEGF Humana Recombinante	R&d	293-VE-010
Proteína humana recombinante SCF (C-Kit Ligand)	Thermofisher	PHC2111
StemPro hESC SFM	Thermofisher	A1000701
Ferramenta de Passagem de Células-Tronco Descartáveis StemPro EZPassage	Thermofisher	23181010
Placas de fixação ultrabaixas: Placa multipoços de cultura de células, 6 poços, superfície repelente de células estrela de células	Greiner	Nº 657970
2-Mercaptoetanol (50 mM)	Invitrogen	31350010
DPBS, cálcio, magnésio (500ml)	Thermofisher	14040091
Suplemento GlutaMAX	Thermofisher	35050061