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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em São Francisco e foram conduzidos de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Colete DRG lombar de camundongos experimentais
- Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) misturando 9 volumes do meio com 1 volume de 10x HBSS livre de Ca++/Mg++. Mantenha-o no gelo.
- Anestesie o mouse com 2,5% de Avertin. Confirme se o animal está totalmente anestesiado pela falta de resposta ao beliscão da pata traseira.
NOTA: Foram utilizados camundongos machos e fêmeas com idades entre 6 e 8 semanas.
- Perfunda o camundongo transcardiologicamente com 10 mL de PBS 1x pré-resfriado.
- Coloque o mouse na posição supina com quatro patas presas com a fita dentro de uma capela de exaustão química. Levante a pele abaixo da caixa torácica com a pinça e faça uma pequena incisão com uma tesoura cirúrgica para expor o fígado e o diafragma.
- Continue a usar uma tesoura para cortar o diafragma e a caixa torácica e abra a cavidade pleural para expor o coração batendo.
- Corte rapidamente o apêndice atrial direito com uma tesoura de íris. Uma vez observado o sangramento, insira uma agulha de 30 G na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mL de PBS 1x pré-resfriado para perfundir o animal.
- Realize laminectomia dorsal no camundongo colocado em decúbito ventral.
nota: Se a cultura de células for planejada, borrife o camundongo com etanol a 70% antes da incisão e use instrumentos cirúrgicos pré-esterilizados para dissecação.
- Use um bisturi tamanho 11 para fazer uma incisão lateral profunda longitudinal começando da região torácica até a região sacral. Remova a pele com a tesoura para expor a camada muscular dorsal.
- Use Friedman-Pearson Rongeur para descascar os tecidos conjuntivos e músculos até que os processos da coluna lombossacral e os processos transversos bilaterais sejam expostos.
- Use uma tesoura de mola Noyes para abrir cuidadosamente a coluna vertebral dorsal e, em seguida, mude para um Friedman-Pearson Rongeur para remover os ossos vertebrais para expor a medula espinhal com os nervos espinhais intactos presos.
- Disseque cuidadosamente o DRG lombar ipsilateral e contralateral (L4/L5 DRG em nosso estudo) e coloque-o em 1 mL de 1x HBSS sem Ca++/Mg++ gelado em um homogeneizador de tecido Dounce. Agora os lenços estão prontos para a etapa 2.
nota: Apare o nervo espinhal ligado ao DRG, se possível.
2. Isole células individuais do DRG lombar de camundongo
- Homogeneizar o tecido DRG com um pilão solto no homogeneizador Dounce 20-25 vezes.
- Coloque um filtro de células de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL. Molhe o filtro de células com 800 μL de 1x HBSS gelado e o fluxo é coletado no tubo cônico.
- Recolher a suspensão de tecido homogeneizado do homogeneizador com uma pipeta e passar através do filtro de células de nylon húmido de 70 μm para o tubo cónico de 50 ml.
- Enxágue o homogeneizador duas vezes com 800 μL de 1x HBSS gelado e depois decanta-o no mesmo tubo cônico de 50 mL com um filtro de células para aumentar o rendimento.
- Adicione 1,5 mL de meio de gradiente de densidade isotônico gelado equilibrado (preparado na etapa 1.1) em um tubo FACS de poliestireno estéril de 5 mL.
- Transfira o homogeneizado de células do tubo cônico de 50 mL (na etapa 2.4) para o tubo FACS e misture bem com o meio de gradiente de densidade pipetando para cima e para baixo. Adicione mais 500 μL de 1x HBSS para selar a parte superior.
- Pulverizar as células por centrifugação a 800 x g durante 20 min a 4 °C.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante contendo mielina no meio sem perturbar o pellet celular na parte inferior do tubo FACS.
- Ressuspenda as células em tampão PBS ou FACS contendo 5% de soro fetal bovino (FBS) para análise de FACS.
nota: Pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas do DRG L4 / L5 de um camundongo.
- Ressuspenda as células DRG mecanicamente isoladas (L4 / L5) em 100 μL de PBS contendo 5% de soro fetal bovino e, em seguida, incube com anticorpo CX3CR1-APC de camundongo α (1: 2.000) no escuro a 4 ° C por 1 h.
- Lave as células com 5 ml de PBS uma vez; centrifugue as células a 360 x g durante 8 min a 4 °C.
- Aspire o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 300 μL de PBS para análise FCAS. Se a classificação de células for planejada, ressuspenda as células no buffer FACS.