Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Excisão cirúrgica e etapas de preparação do tecido:
- Remoção cirúrgica do intestino delgado (SI)
- Eutanasiar camundongos usando asfixia por CO2 ou qualquer método equivalente aprovado pelo comitê institucional de ética animal.
- Transfira o mouse para uma área dedicada para excisão cirúrgica. Coloque o traseiro para baixo e hlimpe o abdômen com etanol 70%. Realize uma laparotomia cortando a pele abdominal e o peritônio ao longo da linha média do púbis até a caixa torácica, abrindo assim a cavidade peritoneal.
nota: Realize a primeira incisão em uma área relativamente pequena da pele para evitar penetrar na cavidade peritoneal e danificar o tecido intestinal. Continue a excisão até a borda anatômica desejada.
- Identifique o ceco, que é um ponto de referência ideal para a detecção do íleo terminal, que constitui o segmento distal do intestino delgado.
nota: O ceco geralmente está localizado no lado inferior esquerdo do abdômen do camundongo.
- Identifique a junção ileocecal e faça um corte neste nível o mais distal possível para separar o intestino delgado do ceco. Ao longo das próximas etapas, evite o contato físico excessivo com a parede intestinal, pois os PPs frágeis colapsam facilmente ao toque.
- Remova suavemente todo o intestino delgado até o esfíncter pilórico, cortando o mesentério usando uma tesoura. Identifique a junção entre o piloro e o duodeno, e corte o duodeno nesse nível, o que levará ao descolamento completo do intestino delgado da cavidade abdominal.
NOTA: (i) Evite a hiperextensão, pois isso pode causar a ruptura da parede intestinal. (ii) Se o isolamento de linfócitos LP for desejado além dos linfócitos PP, é necessária a remoção completa da gordura mesentérica. No entanto, apenas para o isolamento de PP, a gordura mesentérica remanescente pode fornecer alguns benefícios durante as etapas adicionais de isolamento; portanto, deve ser preservado.
- Coloque o intestino delgado destacado em uma placa de 6 poços cheia de RPMI frio + 10% de soro fetal bovino (FBS) e agite suavemente os tecidos manualmente até que todos os segmentos intestinais estejam submersos no meio frio. Mantenha os tecidos no gelo durante as próximas etapas.
- Depois de dissecar o número desejado de intestino delgado de camundongo, prossiga para a excisão de PP do intestino delgado coletado.
- Excisão cirúrgica de PPs e preparação de suspensão de célula única:
- Transfira suavemente o intestino delgado em uma toalha de papel, segurando a gordura mesentérica usando uma pinça e colocando o lado mesentérico voltado para a toalha de papel. Umedeça todo o segmento intestinal com RPMI frio + 10% FBS para evitar desidratação e viscosidade dos tecidos.
nota: A gordura mesentérica restante pode ser útil nesta fase, porque os segmentos de tecido adiposo no lado mesentérico do SI grudam na toalha de papel, mantendo o lado antimesentérico voltado para cima.
- Identifique os PPs, que aparecem como agregados brancos multilobulados em forma de "couve-flor" no lado antimesentérico da parede intestinal.
nota: A lavagem do conteúdo luminal não é recomendada até que todos os PPs sejam excisados. Esvaziar o conteúdo luminal pode causar o colapso dos PPs e evitar o contraste de cores entre os PPs e a parede intestinal, o que é muito útil para a identificação visual dos PPs.
- Após identificar PPs no lado antimesentérico, coloque a tesoura cirúrgica de extremidade curva sobre PPs (a curva deve estar voltada para cima) restringindo a PP de sua borda distal e proximal.
opcional: Empurre o PP suavemente em direção às lâminas da tesoura usando a ponta do dedo. Essa manobra levará à melhor exclusão do tecido não PP circundante. Extirpar os PPs suavemente, excluindo o tecido intestinal circundante.
NOTA: (i) Esta etapa é crucial para obter o rendimento máximo de células PP, minimizando a contaminação celular de compartimentos intestinais vizinhos, como LP e epitélio intestinal, que também são ricos em células T. (ii) De um SI excisado de um camundongo C57BL / 6, 5-10 PPs (tamanho médio, multilobulado) podem ser coletados. Ao apontar para PPs ainda menores (não multilobulados), a coleta de até 12-13 PPs por camundongo (C57BL / 6) é possível usando este protocolo.
- Transfira os PPs excisados para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços preenchida com RPMI gelado + FBS a 10% e mantida no gelo usando fórceps ou tesoura cirúrgica curva.
NOTA: (i) Imediatamente após a excisão de PPs, o muco e o conteúdo intestinal na superfície do PP podem ser limpos esfregando o tecido suavemente em uma toalha de papel. Esta etapa ajudará a melhorar a viabilidade dos linfócitos PP. (ii) Em vez de transferir os PPs para uma placa, a transferência para tubos separados também pode ser considerada dependendo do número total da amostra.
- Opcional: Quando a excisão de PP e a subsequente colocação na placa de poço são concluídas, o número e o tamanho dos PPs coletados de diferentes grupos experimentais/de camundongos podem ser documentados tirando uma foto da placa de cultura de tecidos contendo PPs.
- Prepare um conjunto de tubos cônicos de 50 mL cheios de 25 mL de RPMI + 10% de FBS (pré-aquecido a 37 ° C). Usando uma tesoura, corte a borda de uma ponta de 1.000 μL à distância que permitirá a aspiração dos PPs com uma pipeta de 1 mL. Aspire os PPs com uma pipeta de 1 mL e transfira-os da placa de cultura de tecidos de 12 poços para os tubos cônicos de 50 mL preparados.
nota: Use uma nova ponta para cada amostra de camundongo para evitar contaminação cruzada entre as amostras.
- Feche a tampa e coloque os tubos verticalmente em um agitador orbital a 37 °C, com agitação contínua a 125–150 rpm por 10 min. Enquanto isso, prepare um novo conjunto de tubos de 50 mL e coloque um filtro de células de 40 μm no topo de cada tubo, através do qual será preparada a suspensão unicelular.
NOTA: (i) A etapa de agitação removerá o conteúdo intestinal restante, muco e detritos celulares, que diminuem a viabilidade celular e a recuperação dos linfócitos PP se não forem removidos. (ii) Não aplique nenhum tipo de enzima digestiva no tecido PP porque o processo de digestão causa uma perda dramática da expressão de CXCR5 da superfície celular.
- Após a agitação, transfira os PPs para o filtro de células de 40 μm colocado na parte superior dos tubos cônicos de 50 mL recém-preparados. Usando o lado arredondado de um êmbolo de seringa de 10 mL, interrompa suavemente os PPs através do filtro de células para gerar uma suspensão de célula única. Enxágue o filtro com 15–20 mL de RPMI frio + 10% FBS.
NOTA: (i) Antes de filtrar, agite os tubos que contêm os PPs horizontalmente. Este shake curto facilitará a transferência de PPs para filtros de células. (ii) Recomenda-se o uso de um filtro de células de 70 μm para o isolamento de células imunes não linfóides (por exemplo, monócitos, macrófagos, DCs).
- Centrifugue as suspensões unicelulares a 350–400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células a uma concentração de 10 x 106 células / mL. Conte as células usando um hemocitômetro.