Isolamento de células mononucleares do sangue periférico de revestimentos de buffy humanos

Resumo

Fonte: Mily, A., et al. Polarização de células derivadas de monócitos humanos M1 e M2 e análise com citometria de fluxo na infecção por Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs, contendo monócitos e linfócitos de um revestimento leucocitário humano por centrifugação com gradiente de densidade. Os PBMCs isolados podem ser usados para análise posterior.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação de mídia

NOTA: Detalhes sobre todos os reagentes e consumíveis são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Meio completo de RPMI: Suplemento RPMI 1640 com 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES e 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS). Evite antibióticos no meio de cultura de células ao trabalhar com infecção por MTB.
2. Meio RPMI sem soro: Suplemento RPMI 1640 com 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina e 10 mM de HEPES.

2. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico de revestimentos leucocitários

NOTA: Execute todo o trabalho com sangue humano (potencialmente contagioso) dentro de um gabinete de biossegurança classe II. Inative os produtos sanguíneos residuais com desinfetantes por 15 minutos antes de descartá-los. O sangue foi obtido de voluntários saudáveis neste caso. Este protocolo de diferenciação de macrófagos in vitro foi configurado para incluir 10 x 10⁶ PBMCs isolados / doador / poço. De cada doador, um revestimento leucocitário contém cerca de 50 mL de uma suspensão leucocitária concentrada originária de sangue total, que normalmente fornece 500-800 x 10⁶ PBMCs, dos quais aproximadamente 10% ou 50-80 x 10⁶ monócitos podem ser recuperados.

1. Carregue 15 mL de sangue de revestimento leucocitário em cima de 15 mL de meio de gradiente de densidade preparado em um tubo de 50 mL. Sobreponha lentamente o sangue sobre a camada de gradiente de densidade, inclinando a ponta da pipeta para a parede do tubo.
2. Gire os tubos a 600 x g por 25 min em temperatura ambiente (RT) com 0 aceleração e 0 desaceleração.
   nota: Feche as tampas cuidadosamente antes da centrifugação e sempre verifique os suportes dos tubos quanto a possíveis respingos após a centrifugação.
3. Remova a camada superior de plasma com uma pipeta Pasteur estéril e, em seguida, colete cuidadosamente a camada de células mononucleares em um novo tubo de 50 mL usando uma pipeta Pasteur estéril. Adicione meio RPMI sem soro ao pellet PBMC para obter um volume final de 50 mL. Misture cuidadosamente invertendo o tubo algumas vezes antes da centrifugação a 500 x g por 5 min em RT.
4. Descarte o sobrenadante com cuidado e ressuspenda o pellet celular virando o fundo do tubo entre os dedos.
5. Para remover a contaminação do meio de gradiente de densidade dos PBMCs, lave as células 2 a 3 vezes com RPMI sem soro para obter um volume final de 50 mL. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a RT. Lavar até que o sobrenadante da célula se torne transparente.
6. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 20 mL de meio RPMI sem soro.
7. Conte as células por coloração com azul de tripano, manualmente usando um hemocitômetro ou usando um contador de células automatizado. Dilua a suspensão celular em azul de tripano em diluição 1:2 ou 1:10 misturando a amostra de azul de tripano em uma placa de 96 poços, por exemplo, 50 μL + 50 μL (para contagem de hemocitômetros) ou 10 μL + 10 μL (para contagem automatizada de células) e conte as células para obter o número de células vivas/mL.
   cuidado: O azul de tripano é tóxico e deve ser descartado em um resíduo químico separado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linfoprep	Alere Technologies AS	11508545
RPMI 1640	Corporação de Tecnologias da Vida	SH30096.01
EDTA (0,5 M)	Hospital Universitário Karolinska, Huddinge	N/A
Na-piruvato	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH300239.01
L-Glutamina	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH30034.01
HEPES	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH30237.01
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524