Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Diferenciação e polarização de células derivadas de monócitos
- Use aderência plástica para isolamento de monócitos. Resumidamente, semeie células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) recém-isoladas em uma placa de cultura de 6 poços em uma concentração apropriada, por exemplo, 10 x 106 PBMCs/poço em meio RPMI sem soro de 2 mL (Suplemento RPMI 1640 com 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina e 10 mM de HEPES) e incube a 37 ° C e 5% de CO2.
- Após 2–3 h, remova as células não aderentes com uma pipeta e lave os poços 3 vezes com 1 mL de meio sem soro. As células anexadas são monócitos e compreendem cerca de 10% do total de PBMCs adicionadas ao poço, ou seja, 106 monócitos recuperados de 10 x 106 PBMCs adicionados por poço.
- Para diferenciação de macrófagos, prepare uma solução de trabalho contendo 50 ng/mL GM-CSF ou M-CSF para polarização de macrófagos M1 e M2, respectivamente, adicionados em 2 mL de meio completo RPMI por poço. Cultivar as células numa incubadora de CO2 a 5% a 37 °C durante 3 dias.
- No dia 3, remova 1 mL do meio de cultura de células cuidadosamente da camada superior de cada poço e complemente as culturas de células com 1 mL de meio RPMI completo fresco contendo a dupla concentração de M-CSF ou GM-CSF para obter 50 ng/mL de concentração final nos poços. Adicione os fatores de crescimento em uma solução de trabalho pré-fabricada de 100 ng/mL/poço.
- No dia 6, adicione estímulos diferentes nas últimas 18 a 20 h de diferenciação celular para obter M1 totalmente polarizado e maduro (interferon-γ; IFN-γ e lipopolissacarídeo; LPS (E. coli O55:B5)) ou M2 (interleucina 4; IL-4). Para polarização M1, prepare IFN-γ e LPS em meio completo RPMI (suplemento RPMI 1640 com 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES e 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS)) e adicione 50 μL por poço para obter uma concentração final de 50 ng/mL de IFN-γ e 10 ng/mL de LPS nas culturas de células. Para polarização M2, preparar IL-4 em meio RPMI completo e adicionar 50 μL por alvéolo para obter uma concentração final de 20 ng/mL nas culturas celulares.
- Para diferenciação de macrófagos polarizados M0, estimule as células apenas com M-CSF, sem citocinas adicionais (fornecendo um fenótipo semelhante ao M2).
- Verifique a morfologia das culturas de células derivadas de monócitos regularmente com microscopia de luz para garantir que monócitos menores sejam diferenciados em células maiores semelhantes a macrófagos. Além disso, monitore as possíveis diferenças morfológicas entre a polarização M1 e M2, ou seja, células M1 alongadas e esticadas em comparação com células M2 com formato mais arredondado.
