Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de células alimentadoras AC-6
Nota: A linhagem de células estromais AC-6.21 (AC-6 em resumo) (fornecida por I. Weissman, Universidade de Stanford) deve ser mantida em RPMI suplementada com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS). Para servir como células alimentadoras, as células AC-6 são γ-irradiadas com 3.000 rad (30Gy) um dia antes da co-cultura para evitar sua proliferação. Observe que as células AC-6 tendem a perder sua capacidade de suporte de diferenciação se deixadas superlotadas durante a manutenção ou se seu número de passagem for superior a 20.
- Lave as células AC-6 uma vez com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e remova a DPBS por aspiração. Trate as células AC-6 com 0,8 ml de solução de tripsina (0,05% de tripsina e 0,5 mM de EDTA em DPBS) por 3-5 min a 37oC, 5% de CO2 e, em seguida, pare a reação diluindo-a com 10 volumes de meio de cultura para fazer uma suspensão de célula única.
- Semeie células AC-6 a 5,9x104 células/poço em placas de 12 poços e incube-as a 37oC, 5% CO2 O/N.
nota: A densidade das células AC-6 é muito importante, pois uma densidade mais baixa favorecerá a geração de cDC. A semeadura a uma densidade de 5,9x104 células/poço permitirá que o AC-6 atinja a confluência no dia seguinte, o que é ideal para a derivação de pDCs de CLPs.
- Irradiar células AC-6 a 3.000 rad (30 Gy) usando γ-irradiador.
Nota: A dose usada para irradiar AC-6 é otimizada para evitar que as células proliferem e ainda mantê-las viáveis por tempo suficiente para fornecer as citocinas e o contato célula-célula necessários para a diferenciação de DCs de CLPs.
- Aspirar o meio e substituir por 1 ml de RPMI completo (RPMI com 10% de FBS inativado pelo calor, 50 μg/ml de gentamicina e 50 μM de β-mercaptoetanol).
2. Isole células BM de camundongos
- Sacrifique camundongos por asfixia por CO2 e luxação cervical. Coloque os camundongos em uma bandeja de dissecação e esterilize-os com etanol a 70%. Faça uma incisão no meio do abdômen e remova a pele da parte distal do camundongo, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores.
- Disseque os ratos em um capuz semi-estéril. Para liberar o fêmur e a tíbia, corte o fêmur acima e as tíbias abaixo da articulação do joelho. Separar os músculos dos ossos com uma tesoura e colocá-los numa placa de Petri de 6 cm contendo 5 ml de RPMI completo.
- Mude para uma capa de cultura estéril. Encha uma seringa de 3 ml conectada a uma agulha 27G com RPMI completo. Corte ambas as extremidades dos ossos usando uma tesoura e insira a agulha 27G para remover a medula dos ossos, injetando suavemente o RPMI completo uma vez em cada extremidade.
- Prepare uma suspensão unicelular pipetando suavemente as células para cima e para baixo 3-5 vezes na placa de cultura usando a seringa sem a agulha.
- Centrifugue as células por 5 min a 500 x g e transvase o sobrenadante.
- Lise os glóbulos vermelhos com 1 ml de tampão ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) incubando por 1 min e interrompendo a reação diluindo com 10 volumes de RPMI completo. Deixe as células repousarem por 5 minutos para derrubar aglomerados de células mortas e detritos de tecido por gravidade.
nota: Não deixe repousar por mais de 5 minutos, pois isso resultará em perda de células devido ao assentamento de células viáveis.
- Decantar lentamente o sobrenadante contendo células para um novo tubo, deixando detritos para trás no tubo original.
- Centrifugue por 5 min a 500 x g para pellet as células, depois remova e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda o total de células BM (normalmente 4-6 x 10,7 células BM são obtidas de um camundongo) em 100 μl de tampão FACS (1x PBS + 2% FBS + 1mM EDTA).
3. Análise FACS e Ordenação de CLPs
- Adicione anti-CD16/32 (clone do hibridoma sobrenant 2.4G2, 50 μl/reação ou 1-2 μg/reação) nas células em tampão FACS (etapa 2.9) por 1-2 min para bloquear os receptores Fc.
nota: O anti-CD16/32 também é chamado de bloqueio Fc, que é adicionado para evitar a ligação não específica de anticorpos a células que expressam receptores Fc, incluindo granulócitos, monócitos e linfócitos B.
- Simultaneamente corar as células com os seguintes anticorpos marcados com corante fluorescente (para 4x107 células) por 15 min no gelo, evitando a luz ambiente. Anticorpos: marcadores de linhagem conjugados com PE (0,0,00 2 μg cada) incluindo anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti-Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) e anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg anti-M-CSFR-APC (AFS98) e 0,2 μg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Lave as células com 3 ml de tampão FACS e centrifugue por 5 min a 500 x g.
- Ressuspenda as células em tampão FACS de 300 μl e filtre as células através de um filtro de células de 40 μM.
- Lave o tubo com um tampão FACS adicional de 100 μl para recuperar quaisquer células restantes e filtre para um tubo de classificação FACS estéril usando o mesmo filtro de células.
- Realize a análise de citometria de fluxo imediatamente após a coloração usando filtros e tensões apropriados para detecção de sinal. Use um laser de 488 nm para detectar os anticorpos marcados com FITC, PerCP-Cy5.5, um laser de 561 nm para detectar os anticorpos marcados com PE e PE-Cy7 e um laser de 633 nm para detectar o anticorpo marcado com APC.
- Classifique os CLPs de acordo com os seguintes marcadores: lin-c-kit intSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+ (conforme corado na etapa 3.2) usando um classificador de células. Recolha as células separadas num tubo de 15 ml contendo 8 ml de RPMI completo como almofada.
- Registre o número absoluto de células classificadas, conforme mostrado pelo classificador de células no final da execução. Normalmente, 5x104 CLPs podem ser obtidos do BM de um mouse.
4. CLPs de cocultura e AC-6
- Centrifugue as células classificadas da etapa 3.7 por 10 min a 500 x g, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com RPMI completo suficiente para obter uma densidade celular de cerca de 5x104 células / ml. Semear 500 células / poço na placa de 12 poços contendo células alimentadoras preparadas na etapa 1.4.
- Adicionar 100 ng/ml de FL (hu-Flt3L-Ig gerado internamente usando um sistema de expressão fornecido por M. Manz, Hospital Universitário de Zurique, Suíça) e incubar a 37oC, 5% de CO2 com monitoramento visual periódico do desenvolvimento da DC sob um microscópio.
nota: FL humano recombinante disponível comercialmente ou FL de camundongo pode ser usado como um substituto para hu-Flt3L-Ig para apoiar o desenvolvimento de DC.
- Colete as células no sobrenadante no dia 12 e lave os poços uma vez com 0,5 ml de meio RPMI completo combinando os sobrenadantes resultantes. Adicione 0,5 ml de meio fresco e descarte as células aderentes com um raspador de células.
- Combine o meio contendo células de ambas as partes e centrifugue por 5 min a 500 x g.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão FACS de 50 μl. Adicione 50 μl de sobrenadante de hibridoma anti-CD16 / 32 e incube por 1-2 min para bloquear os receptores Fc.
- Enumere e core todas as células com os seguintes anticorpos (0,05 μg cada): anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE.
- Lave e centrifugue as células conforme descrito na etapa 3.3.
- Ressuspenda as células em tampão FACS de 100 μl, gate em CD11c + e analise cDCs (CD11c + CD11b + B220-) e pDCs (CD11c + CD11b-B220 +).
