Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
- Preparação do reagente
- Prepare PBS/EDTA: solução salina tamponada com fosfato (PBS) e suplemente com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM. Esterilizar esta solução por filtração através de um filtro de 0,2 μm. NOTA para armazenar PBS / EDTA a 4 ° C e aquecer à temperatura ambiente antes de usar.
- Prepare o tampão de coloração: suplemento de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 2% de soro fetal bovino (FBS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) 10 mM e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM. Esterilizar esta solução por filtração através de um filtro de 0,2 μm.
- Colete sangue do Blood Cone
nota: O cone de sangue contém componentes de glóbulos brancos coletados após a plaquetaférese do hospital. Se o sangue for coletado em tubos de heparina ou EDTA, dilua o sangue com PBS na proporção de 1:1 e prossiga para a etapa 1.3; se um buffy coat for recebido, dilua o buffy coat com PBS na proporção de 1:2 e prossiga para a etapa 1.3.
- Corte as duas extremidades do cone para permitir que o sangue flua para um tubo de 50 ml.
Observe que o cone geralmente contém 10 ml de sangue.
- Use uma seringa de ponta romba contendo 30 ml de PBS / EDTA para lavar o cone e colete-o em um tubo de 50 ml.
- Diluir ainda mais o sangue com PBS/EDTA até um volume final de 80 ml.
- Isolamento de PBMCs por centrifugação por densidade
- Alíquota de 15 ml de Ficoll cada para 4 tubos frescos de 50 ml.
- Utilizar uma pipeta serológica de 25 ml para adicionar 20 ml de sangue diluído sobre a camada de Ficoll. Observe para segurar o tubo de 50 ml em um ângulo de 45 e tome cuidado para não perturbar a interfase.
- Centrifugar os tubos a 805 x g sem travões durante 30 min, 20 °C.
- Remova a camada de plasma e colete o anel de PBMCs que fica logo abaixo da camada de plasma com uma pipeta de Pasteur. Combinar quatro tubos de PBMCs em dois tubos de 50 ml. Observe para evitar coletar a camada transparente abaixo dos PBMCs.
- Adicionar PBS/EDTA a um volume final de 50 ml por tubo de PBMCs e centrifugar a 548 x g com travões durante 10 min, 20 °C.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em cada tubo com 25 ml de tampão de coloração e combinar num tubo de 50 ml.
- Centrifugar a 367 x g com travões durante 5 min, 4 °C.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de coloração.
2. Enriquecimento de monócitos por separação magnética
- Determinar o número da célula
- Pegue 20 μl de suspensão de células PBMC e misture-o com 20 μl de azul de tripano para contar o número de células vivas usando um citômetro.
- Suspensão da célula centrífuga a 367 x g com freios por 10 min, 4 °C.
- Aspirar completamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular a uma concentração de 107 células por 80 μl de tampão de coloração.
- Rotulagem Magnética
- Adicione 20 μl de microesferas CD14 por 107 células, misture bem e incube por 15 min a 2 - 8 ° C.
- Lave as células adicionando 1 ml de tampão de coloração por 107 células e centrifugue a 367 x g com travões durante 10 min, 4 °C.
- Aspirar completamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular numa concentração de 107 células por 50 μl de tampão de coloração.
- Separação magnética
- Use coluna de tamanho médio para um máximo de 2 x 108 células no total.
nota: Escolha uma coluna e separador apropriados de acordo com o número de células totais e o número de células CD14+ recomendado na folha de dados.
- Colocar a coluna no campo magnético de um separador adequado e preparar a coluna enxaguando-a com 500 μl de tampão de coloração.
- Pipetar a suspensão de células na coluna e recolher as células não marcadas que passam através da coluna com um tubo de 15 ml.
- Substitua um novo tubo de 15 ml sob a coluna e lave a coluna 3 vezes com 500 μl de tampão de coloração. Certifique-se de que o reservatório da coluna esteja vazio antes de adicionar um novo tampão de coloração entre as lavagens.
- Retirar a coluna do separador e colocá-la sobre um novo tubo de 15 ml.
- Pipetar 1 ml de tampão de coloração para a coluna. Lave imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo (fornecido no kit) para dentro da coluna.
- Repita as etapas 2.3.2 a 2.3.6 usando a fração eluída em uma nova coluna para aumentar a pureza das células CD14+. Observe que as esferas serão liberadas das células automaticamente na cultura durante a etapa 3.2.
3. Diferenciação de células dendríticas para diferentes estados de ativação
- Preparação do reagente (o nível de endotoxina deve ser inferior a 0,1 UE/ml em todos os reagentes)
- Prepare o meio de cultura celular: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA) e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol (2ME). Esterilizar esta solução por filtração através de um filtro de 0,2 μm.
- Preparar citocinas: reconstituir IL-4 e GM-CSF em água para cultura de células a uma concentração de 0,25 mg/ml, respectivamente, em condições assépticas. Alíquota citocinas em tubos de microcentrífuga de 200 μl e armazená-los a -80 °C.
- Preparar o estoque de vitamina D3: reconstituir a vitamina D3 em água de cultura de células até uma concentração de 100 mM em condições assépticas. Alíquota de vitamina D3 em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e conservar a -20 °C.
- Preparar estoque de dexametasona: reconstituir a dexametasona em água de cultura de células até uma concentração de 10 mM em condições assépticas. Alíquota dexametasona em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e conservar a -20 °C.
- Prepare o LPS: reconstitua os lipopolissacarídeos (LPS) em água de cultura de células até uma concentração de 1 mg / ml em condições assépticas. Alíquota LPS em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 °C.
- Gerando diferentes moDCs
- Semear 4 conjuntos de monócitos CD14+ na concentração de 0,3 - 0,5 x 106/ml de meio de cultura celular suplementado com 200 ng/ml de GM-CSF e 200 ng/ml de IL-4 em placas de 6 poços. Observe que este é o dia 0 e o volume do meio em cada 6 poços é de 2 ml.
- Incubar as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 °C com 5% de CO2.
- Remover 850 μl de meio da cultura no dia 4 e centrifugar a 300 x g durante 5 min, 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de cultura celular contendo 2x de (200 ng/ml de GM-CSF e 200 ng/ml de IL-4). Adicione esta mistura de células de volta à cultura. Observe que a concentração de 2x adicionada para GM-CSF e IL-4 se tornará 1x quando 1 ml de meio for adicionado de volta à cultura.
- Adicione 1 μl de estoque de vitamina D3 e 1 μl de estoque de dexametasona por ml de meio a dois dos conjuntos no Dia 5 para gerar moDCs tolerogênicos. Observe que a concentração final de vitamina D3 é de 100 nM e a dexametasona é de 10 nM; a adição de GM-CSF e IL-4 não é necessária no Dia 5.
- Adicione 200 ng/ml de GM-CSF e 200 ng/ml de IL-4 a todos os conjuntos no Dia 6.
- Adicionar 1 μg/ml de LPS a um dos conjuntos tratados apenas com GM-CSF e IL-4 no dia 6 para gerar moDCs maduros.
- Adicione 1 μg/ml de LPS a um conjunto de moDCs tolerogênicos no Dia 6 para gerar moDCs tolerogênicos a LPS.
- Colha os diferentes tipos de moDCs no dia 7 lavando a placa de cultura com PBS, EDTA para citometria de fluxo ou outros estudos. Observe que apenas as células não aderentes são colhidas. Observe que o rendimento percentual de monócitos CD14+ para moDCs imaturos, moDCs maduros, moDCs tolerogênicos e DCs tolerogênicos a LPS é de cerca de 90%, 50%, 60% e 60%, respectivamente, e varia entre doadores de sangue e lote de FBS.
