Isolamento e purificação de células B do sangue periférico humano

Resumo

Fonte: Tzeng, S. J. O Isolamento, Diferenciação e Quantificação de Células B Secretoras de Anticorpos Humanos do Sangue: ELISpot como uma Leitura Funcional da Imunidade Humoral. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células B do sangue periférico humano usando anticorpos biotinilados específicos para células não B e microesferas magnéticas conjugadas com estreptavidina.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local

1. Isolamento e Purificação de Células B do Sangue Periférico Humano

1. Retire ~ 10 mL de sangue da veia cubital mediana (na fossa cubital anterior ao cotovelo) em um tubo de 15 mL contendo K₂EDTA (1,5 a 2,0 mg / mL de sangue) e inverta imediatamente o tubo várias vezes para evitar a formação de coágulos.
2. Adicione 35 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) autoclavado (121 °C, 15 min) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ e 1 mM EDTA; pH 7,4) ao tubo contendo a amostra de sangue fresco (≥ 3:1 vol/vol) e incube em temperatura ambiente (RT) por não mais de 5 min.
   nota: O aparecimento de transmissão de luz através do tubo indica a conclusão da lise das hemácias.
3. Centrifugue a 600 x g em RT por 5 min. Certifique-se de que o pellet seja de cor branca.
4. Ressuspenda o pellet com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄ e 1,47 mM KH₂PO₄; pH 7,4) e centrifugue como na etapa 1.3.
5. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet com 10 mL de meio RPMI 1640 (suplementos: 10% de soro fetal de bezerro, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 0,25 μg / mL de anfotericina B e 2 mM de L-glutamina) e, em seguida, coloque as células em uma placa de cultura de 10 cm (10 mL de sangue por placa). Coloque o prato em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ por 30 min.
6. Agite suavemente a placa de cultura algumas vezes e coloque o meio de cultura (células em suspensão) em tubos cônicos de plástico de 15 mL. Descarte as células aderentes (principalmente macrófagos) nas placas de cultura.
7. Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante.
8. Ressuspenda o pellet com 1 mL de meio RPMI 1640. Conte o número de células com um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
   nota: A viabilidade dos leucócitos isolados é normalmente superior a 90% pela exclusão do azul de tripano.
9. Centrifugue como na etapa 1.7 e ressuspenda as células em ~ 200 μL de tampão PBS frio (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA) na concentração de 5 - 10 x 10⁶ células / mL.
10. Adicione 5 μL de coquetel de Ab anti-humano biotinilado específico para células sanguíneas (para a seleção negativa de células B) por 10⁶ células e incube em gelo por 30 min.
    nota: O coquetel anti-Ab humano deve incluir pelo menos Abs específicos para CD2 (ou CD3), CD14 e CD16.
11. Adicione um volume 10 vezes maior de PBS estéril às células, centrifugue a 600 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
12. Adicione quantidades iguais de microesferas conjugadas com estreptavidina (5 μL por 10⁶ células) ao pellet e misture bem.
13. Incube no gelo por 30 min em um tubo cônico de plástico de 15 mL.
14. Adicione 2 mL de tampão PBS no tubo.
15. Coloque o tubo em um suporte magnético e incube em RT por 8 min. As microesferas marrons se fixarão gradualmente na parede do tubo ao lado do ímã.
16. Com o tubo permanecendo no suporte magnético, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo estéril de 15 mL.
17. Repita as etapas 1.14 a 1.16 e combine os dois sobrenadantes que contêm as células B intocadas. Descarte as microesferas.
18. Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante.
19. Ressuspenda o pellet no meio RPMI 1640 para experimentos a jusante.
    nota: Normalmente, 1 - 5 x 10⁵ células B com pureza superior a 95% de 10 mL de sangue periférico podem ser isoladas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BD Vacutainer K2E	BD Biociências	367525	Tubo de 10 ml
Ficoll-Paque Plus	GE Saúde	17-1440-02	Livre de endotoxinas
Solução de azul de tripano a 0,5%	Indústrias Biológicas	03-102-1B	tingir
Conjunto de enriquecimento de linfócitos B humanos IMag	BD Biociências	558007	Reagente
Microesferas magnéticas de estreptavidina	BD Biociências	9000810	Reagente
Tubos Falcon de 15 ml	Falcão BD	352196	Artigos de plástico
CD27 mAb biotinilado	Biolenda	302804	Clone O323
CD27 anti-humano biotinilado	Biolenda	302804	Clone O323
CD27 anti-humano biotinilado	eBiociência	13-0279-80	Clone O323