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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Classificação de células para a coleção de células B virgens, células B de memória e plasmablastos/plasmócitos (PBs/PCs)
- Usando células B purificadas do sangue periférico humano, determine o número de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
- Ressuspenda as células em tampão PBS frio na concentração de 107 por mL em um tubo de poliestireno de 5 mL.
- Adicione 1 - 2 μg de IgG humano por 106 células e incube no gelo por 10 min para o bloco Fc.
- Adicione 1 μg de anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) e anti-CD38-PE (clone: HIT2) por 106 células; misture bem e incube no gelo por 30 min.
- Nos últimos 5 minutos na etapa 1.4, adicione 5 μL da 7-amino actinomicina D comercial (7-AAD).
- Adicione 2 mL de PBS ao tubo, vórtice e centrifugue a 600 x g por 5 min.
- Ressuspenda as células em tampão de triagem (PBS estéril com 2% de BSA e 2 mM de EDTA) a uma concentração de 1 - 5 x 107 células por mL em um tubo de 15 mL.
- Filtre as células através de um filtro de células de malha de nylon (tamanho de poro de 40 μm) para eliminar aglomerados de células.
- Separe as células com um classificador de citometria de fluxo equipado com três lasers: violeta (405 nm), azul (488 nm) e vermelho (640 nm).
NOTA: O laser azul sozinho é suficiente para citometria de fluxo de 3 cores.
- Classifique as células em três tubos de 15 mL (contendo 5 mL de meio RPMI) para a coleta simultânea de células B virgens (CD19 + CD27-), células B de memória (CD19 + CD27 +) e PBs / PCs (CD19 + CD27 + / hiCD38 +).
nota: As células B ingênuas e de memória classificadas podem ser cultivadas posteriormente.