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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
O sangue periférico humano deve ser obtido de doadores saudáveis sob consentimento informado, e o uso de amostras de sangue deve estar em conformidade com as diretrizes aprovadas estabelecidas pelos conselhos de revisão. Neste estudo, foi utilizado o protocolo de utilização de sangue humano em uma demonstração dos resultados dos ensaios de citometria de fluxo (Figura 1) e ELISpot (Figura 2).
1. Isolamento e Purificação de Células B do Sangue Periférico Humano
- Retire ~ 10 mL de sangue da veia cubital mediana (na fossa cubital anterior ao cotovelo) em um tubo de 15 mL contendo K2EDTA (1,5 a 2,0 mg / mL de sangue) e inverta imediatamente o tubo várias vezes para evitar a formação de coágulos.
- Adicione 35 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) autoclavado (121 °C, 15 min) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 e 1 mM EDTA; pH 7,4) ao tubo contendo a amostra de sangue fresco (≥ 3:1 vol/vol) e incube à temperatura ambiente (RT) por no máximo 5 min.
nota: O aparecimento de transmissão de luz através do tubo indica a conclusão da lise das hemácias.
- Centrifugue a 600 x g em RT por 5 min. Certifique-se de que o pellet seja de cor branca.
- Ressuspenda o pellet com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 e 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) e centrifugue como na etapa 1.3.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet com 10 mL de meio RPMI 1640 (suplementos: 10% de soro fetal de bezerro, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 0,25 μg / mL de anfotericina B e 2 mM de L-glutamina) e, em seguida, coloque as células em uma placa de cultura de 10 cm (10 mL de sangue por placa). Coloque o prato em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 por 30 min.
- Agite suavemente a placa de cultura algumas vezes e coloque o meio de cultura (células em suspensão) em tubos cônicos de plástico de 15 mL. Descarte as células aderentes (principalmente macrófagos) nas placas de cultura.
- Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet com 1 mL de meio RPMI 1640. Conte o número de células com um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
nota: A viabilidade dos leucócitos isolados é normalmente superior a 90% pela exclusão do azul de tripano.
- Centrifugue como na etapa 1.7 e ressuspenda as células em ~ 200 μL de tampão PBS frio (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA) na concentração de 5 - 10 x 106 células / mL.
- Adicione 5 μL de coquetel de Ab anti-humano biotinilado específico para células sanguíneas (para a seleção negativa de células B) por 106 células e incube em gelo por 30 min.
nota: O coquetel anti-Ab humano deve incluir pelo menos Abs específicos para CD2 (ou CD3), CD14 e CD16.
- Adicione um volume 10 vezes maior de PBS estéril às células, centrifugue a 600 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
- Adicione quantidades iguais de microesferas conjugadas com estreptavidina (5 μL por 106 células) ao pellet e misture bem.
- Incube no gelo por 30 min em um tubo cônico de plástico de 15 mL.
- Adicione 2 mL de tampão PBS no tubo.
- Coloque o tubo em um suporte magnético e incube em RT por 8 min. As microesferas marrons se fixarão gradualmente na parede do tubo ao lado do ímã.
- Com o tubo permanecendo no suporte magnético, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo estéril de 15 mL.
- Repita as etapas 1.14 a 1.16 e combine os dois sobrenadantes que contêm as células B intocadas. Descarte as microesferas.
- Centrifugar a 600 x g a RT durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet no meio RPMI 1640 para experimentos a jusante.
nota: Normalmente, 1 - 5 x 105 células B com pureza superior a 95% de 10 mL de sangue periférico podem ser isoladas.
2. Purificação e Separação de Células B de Memória e Virgens de Células B Isoladas
- Use células purificadas da Etapa 1 e determine o número de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
- Ressuspenda as células em 100 μL de tampão PBS frio após centrifugação a 600 x g e RT por 5 min.
- Adicione 1 - 2 μg de mAb CD27 biotinilado por 106 células e incube em gelo por 30 min.
- Adicione 10 mL de tampão PBS ao tubo e centrifugue a 600 x g por 5 min.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 μL de tampão PBS.
- Adicione quantidades iguais de microesferas magnéticas de estreptavidina (1 - 2 μg / 106 células) às células em um tubo cônico de plástico de 15 mL.
- Misture delicadamente e incube no gelo por 30 min.
- Adicione 2 a 3 mL de tampão PBS ao tubo.
- Coloque o tubo em um suporte magnético e incube em RT por 8 min para permitir que as microesferas marrons se prendam ao lado mais próximo do ímã.
- Com o tubo no suporte magnético, transfira cuidadosamente a fração sobrenadante para um novo tubo estéril. Esta fração contém as células B virgens CD27 enriquecidas.
- Adicione 5 mL ao tubo que contém as microesferas e ressuspenda suavemente as microesferas (ou seja, a fração enriquecida de células B de memória CD27+).
- Centrifugue a 600 x g em RT por 5 min. Ressuspenda os pellets com meio RPMI 1640 para os experimentos a jusante.
nota: Normalmente, ~ 30 - 60% das células B podem ser purificadas como células de memória CD27 + das PBMCs de um doador saudável.
3. Classificação de células para a coleção de células B ingênuas, células B de memória e PBs/PCs
- Usando as células purificadas da Etapa 1, determine o número de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
- Ressuspenda as células em tampão PBS frio na concentração de 107 por mL em um tubo de poliestireno de 5 mL.
- Adicione 1 - 2 μg de IgG humano por 106 células e incube no gelo por 10 min para o bloco Fc.
- Adicione 1 μg de anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323) e anti-CD38-PE (clone: HIT2) por 106 células; misture bem e incube no gelo por 30 min.
- Nos últimos 5 minutos na etapa 3.4, adicione 5 μL da 7-amino actinomicina D comercial (7-AAD).
- Adicione 2 mL de PBS ao tubo, vórtice e centrifugue a 600 x g por 5 min.
- Ressuspenda as células em tampão de triagem (PBS estéril com 2% de BSA e 2 mM de EDTA) a uma concentração de 1 - 5 x 107 células por mL em um tubo de 15 mL.
- Filtre as células através de um filtro de células de malha de nylon (tamanho de poro de 40 μm) para eliminar aglomerados de células.
- Separe as células com um classificador de citometria de fluxo equipado com três lasers: violeta (405 nm), azul (488 nm) e vermelho (640 nm).
nota: O laser azul sozinho é suficiente para citometria de fluxo de 3 cores.
- Classifique as células em três tubos de 15 mL (contendo 5 mL de meio RPMI) para a coleta simultânea de células B virgens (CD19 + CD27-), células B de memória (CD19 + CD27 +) e PBs / PCs (CD19 + CD27 + / hiCD38 +).
nota: Células B ingênuas e de memória classificadas podem ser cultivadas conforme descrito na etapa 4.
4. Diferenciação in vitro de células B CD19+ humanas isoladas, células B de memória CD19+CD27+ e células B CD19+CD27- virgens
- Usando as células purificadas nas etapas 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determine o número de células com um hemocitômetro ou um contador automático de células.
- Ressuspenda as células com meio RPMI 1640 a uma concentração de 1 - 10 x10,5 por mL e alicote
- Adicionar CpG (ODN 2006) a 5 μg/106 células/mL.
- Cultivar as células numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 durante 5 dias.
- Colha as células de cada poço, coloque-as separadamente em tubos de 15 mL, adicione 5 mL de PBS a cada tubo e centrifugue-as a 600 x g e RT por 5 min.
- Conte as células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células. Ressuspenda as células a uma concentração de 1 - 10 x 10,5 por mL com meio RPMI 1640.
5. Ensaio ELISpot
- Adicionar 30 μL de etanol a 35% em água destilada a cada poço das placas ELISpot por 30 s.
nota: Ao pipetar, evite tocar na membrana dos poços o tempo todo.
- Inverta as placas ELISpot para remover o etanol.
- Coloque 150 μL de ddH2O autoclavado em cada poço e incube-os em RT por 5 min para lavar o etanol residual; em seguida, lave com uma lavagem de PBS estéril em RT por 3 min.
nota: As etapas 5.1 a 5.3 podem ser opcionais, dependendo da fabricação das placas.
- Colocar 50 μL de 5 μg/ml de fragmento policlonal de F(ab')2 de Ig anti-humana (IgG + IgM + IgA) (em PBS) em cada alvéolo das placas ELISpot e incubá-las a 4 °C durante a noite (de preferência) ou a 37 °C durante 2 h.
nota: Sele as bordas das placas com Parafilm até o uso.
- Inverta as placas para remover o Abs não ligado, adicione 200 μL de PBS a cada poço e incube-as duas vezes em RT por 3 min de cada vez.
- Adicione 200 μL de PBS com 5% de BSA (ou meio RPMI 1640) a cada poço para bloqueio e incube-os em RT por 2 h.
- Inverta as placas para remover o tampão de bloqueio. Lave cada poço duas vezes com 200 μL de PBS, como na etapa 5.5.
- Adicione 100 μL de meio RPMI 1640 a cada poço e incube-os a 37 °C.
- Quando estiver pronto para semear as células, inverta as placas para remover o meio RPMI 1640.
- Semeie 100 μL (5 x 104), 50 μL (2,5 x 104) e 25 μL (1,25 x 104) das células (das etapas 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 e 4.6) nos poços de uma placa ELISpot. Com o meio RPMI 1640, traga o volume para 150 μL/poço.
nota: Recomenda-se um mínimo de uma ou duas diluições seriais de 2 vezes para o revestimento das células.
- Incubar as placas em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 por 8 a 14 h. Evite mover as placas durante a incubação.
- Inverta as placas para remover as células e o meio RPMI 1640.
- Adicione 200 μL/poço de PBS-T (PBS com 0,05% Tween 20) e incube-os 5 vezes em RT, de cada vez por 3 min. Inverta a placa para remover o tampão de lavagem entre cada uma das 5 lavagens.
- Adicione IgG-fosfatase alcalina (AP) anti-IgG humana de cabra, Abs específico de Fcγ (para detecção de IgG, 1:5.000 em PBS-T) ou IgM-AP anti-humano de cabra, Abs específico de fragmento de Fcμ (para detecção de IgM, 1:5.000 em PBS-T) nos poços designados e incube em RT por 2 h no escuro.
- Lave cada poço duas vezes com 200 μL de PBS, como na etapa 5.5.
- Adicionar 50 μL/alvéolo de solução de substrato de bromocloroindolil fosfato-nitro azul de tetrazólio (BCIP/NBT). Manchas de cor roxa normalmente aparecem em 5 a 15 min.
- Adicione 100 μL/poço de ddH2O para evitar o desenvolvimento excessivo de manchas.
- Enxágue as placas com água corrente da torneira após o desenvolvimento completo de todas as manchas.
- Remova o dreno inferior das placas e deixe-as secar ao ar no escuro.
- Conte as manchas usando um leitor de placas automatizado com uma unidade de aquisição/análise de imagens (por exemplo, um scanner automático ou manualmente por meio de um microscópio de dissecação).
nota: As placas podem ser armazenadas na RT no escuro e analisadas posteriormente.
