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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação dos tubos de coleta
- Faça o meio de cultura BMSC suplementando o α mínimo essencial do meio (MEM α) com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
- Coloque 100 μL de meio de cultura BMSC em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Normalmente, 3 ossos cabem em um único tubo, portanto, prepare-se adequadamente.
- Corte as extremidades das pontas da pipeta de 200 μL o suficiente para que caibam nos tubos da centrífuga. Insira as pontas dentro dos tubos e certifique-se de que as tampas possam fechar antes de colocar os tubos no gelo.
nota: Alternativamente, tubos de microcentrífuga de 0,75 mL com as extremidades cortadas podem ser inseridos no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Colheita de ossos de ratos
- Eutanasiar os animais com CO2 seguido de luxação cervical e pulverizá-los com etanol 70%.
nota: Certifique-se de que animais do mesmo sexo e de preferência da mesma idade sejam usados. Usamos rotineiramente animais de 7 a 8 semanas. Recomendamos agrupar células de pelo menos 3 animais por grupo experimental para produzir uma população de células mais representativa e reprodutível.
- Coloque o rato sacrificado de costas em uma placa de dissecação. Use uma pinça para criar uma tenda de pele no abdômen. Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) usando uma tesoura de dissecação estéril. Retire a pele em direção aos membros e aos pés do corte para expor a parte inferior do abdômen e as pernas.
- Corte abaixo da articulação do tornozelo para remover o pé. Corte ao longo da crista ilíaca no quadril para separar a cabeça do fêmur do osso do quadril. Enquanto o rato ainda está de costas, faça uma incisão no meio do osso do quadril para separar os dois ossos ilíacos.
- Usando lenços sem fiapos, remova cuidadosamente o músculo dos fêmures, tíbias e ossos ilíacos.
nota: Cortar o máximo possível dos tendões e músculos do osso torna a limpeza mais rápida e fácil com os lenços sem fiapos (por exemplo, lenços umedecidos). Tenha cuidado ao manipular os ossos, pois eles tendem a quebrar facilmente e sua fragilidade pode ser aumentada com certos genótipos.
- Uma vez que todas as amostras tenham sido dissecadas, coloque-as em PBS no gelo e passe para uma coifa de cultura estéril para as etapas restantes de isolamento.
nota: Trabalhar assepticamente tanto quanto possível reduzirá o potencial de contaminação nas culturas.
- Faça pequenos cortes (aproximadamente 1 a 2 mm) nas extremidades proximal e distal dos ossos antes de colocá-los nas pontas seccionadas dentro dos tubos centrífugos.
nota: Certifique-se de cortar uma quantidade suficiente para que a medula possa ser centrifugada; no entanto, deve-se tomar cuidado para evitar cortar demais, pois as populações de células tendem a variar com base na proximidade dentro do espaço da medula.
- Centrifugue a 10.000 x g por 15 s em temperatura ambiente. Certifique-se de que toda a medula seja lavada e peletizada na parte inferior do tubo de 1,5 mL enquanto os ossos estiverem dentro das inserções (ponta da pipeta de 200 μL ou tubo de microcentrífuga de 0,75 mL). Uma vez coletada toda a medula, remova as inserções com os ossos dos tubos coletores.
nota: Se toda a medula for lavada, os ossos parecerão brancos. No entanto, se a medula permanecer em certos ossos, tente cortar as pontas novamente e centrifugue.
3. Suspensão de células
- Usando uma agulha de 25 G, puxe os grânulos de células para cima e para baixo lentamente para quebrar os aglomerados e combine todas as amostras em um único tubo cônico de 15 mL. Adicione 10 mL de meios de cultura BMSC por 500 μL de amostras.
- Coloque um filtro de 70 μm em cima de um tubo cônico de 50 mL e passe a suspensão celular por este filtro para remover possíveis fragmentos ósseos.
4. Plaqueamento e Cultura de Populações Mistas de Células da Medula Óssea (BMCs Totais)
NOTA: As células são cultivadas a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2.
- Calcule o número de células e coloque-as em placas a 1,0 x 106 células/cm2 em meios de cultura. Aguarde 72 h de cultura mista para que as células se fixem.
nota: Recomendamos diluir a suspensão celular 20x em meio de cultura e diluir novamente em azul de tripano antes de contar as células usando um hemocitômetro. Para camundongos C57Bl6/J machos de 7 semanas de idade, rotineiramente produzimos um número de células de cerca de 50 x 106 células, mas idade, sexo e cepa podem afetar muito o número de células.
nota: Uma população mista de células deve se fixar bem na parte inferior da cultura.
- Após 72 h, remova a mídia e substitua-a por uma nova mídia. Continue trocando a mídia a cada dois dias e verifique a confluência. Quando as células atingem 80-100% de confluência, elas estão prontas para a diferenciação.
nota: Como essa cultura é misturada com BMSCs e HSCs, ela pode ser usada diretamente para osteoblastogênese, adipogênese e osteoclastogênese.
5. Plaqueamento e cultura da população dividida de BMSCs (BMSCs aderentes)
NOTA: As células são cultivadas a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2.
- Coloque todas as células coletadas dos fêmures, tíbias e ossos ilíacos de um camundongo em uma placa de cultura de 10 cm (55 cm2 de área de cultura).
nota: Ao agrupar 2-3 camundongos C57BL / 6J, normalmente colocamos essa população "total" de medula óssea em um frasco de 150 cm2.
- Após 48 h de cultura mista, remova os meios de cultura (contendo as HSCs não aderentes). Se experimentos de osteoclastogênese forem realizados, deixe de lado essa população de células não aderentes, caso contrário, aspire e descarte essas células.
- Lave a placa/balão com PBS cuidadosamente para não perturbar as células anexas.
- Remova o PBS e levante as células adicionando 0,25% de tripsina e incubando a 37 ° C por 1-3 min. Resfrie a tripsina adicionando meio celular à suspensão celular. Neste ponto, os BMSCs, que agora estão levantados, podem ser contados (como feito anteriormente na etapa 4.1) e plaqueados para experimentos futuros.
- Calcule o número de células necessárias para o revestimento. Centrifugue o volume necessário de suspensão de células a 1.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
nota: As células são normalmente revestidas com base em experimentos de ponto final. Por exemplo, se a proteína / RNA deve ser isolada, normalmente colocamos em uma densidade mais alta (~ 1,0-2,0 x 106 células / poço em uma placa de 6 poços).
- Remova o meio e ressuspenda o pellet celular no volume de meio de cultura necessário para o plaqueamento. Coloque as células em meios de cultura de acordo com os experimentos e deixe-as se fixarem por alguns dias. Quando os BMSCs atingirem a confluência, prossiga para realizar a diferenciação.
6. Diferenciação de BMSCs
- Adipócitos
- Faça a mídia de base de adipócitos misturando 90 mL de meio de águia modificado com Dulbecco (DMEM) glicose alta, 10 mL de soro bovino fetal, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 100 μL de 20 mM de Rosiglitazona e 100 μL de 2 mM de insulina. Se necessário, armazene este meio a 4 °C durante a semana durante o experimento de diferenciação.
- Faça meios de indução de adipócitos adicionando 200 μL de 62,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 25 μL de 1 mM de dexametasona a 25 mL de meio de base de adipócitos.
- Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3 ou BMSCs aderentes da etapa 5.6) sejam confluentes, mude o meio para meio de indução de adipócitos. Considere este Dia 0 de diferenciação.
- Após 48 h, remova o meio e refresque a cultura com meio de indução de adipócitos.
- No dia 4, mude para a base do adipócito media.
nota: As gotículas lipídicas podem começar a aparecer já no dia 2 ou no dia 4.
- No dia 7, observe que as células acumularam gotículas lipídicas máximas e exibem um fenótipo semelhante a um adipócito maduro. Não cultive além desse ponto, pois isso pode resultar em morte/descolamento celular.