Isolamento de células T baseado em flotação usando classificação de células ativada por flutuabilidade

Resumo

Fonte: Snow, T., et al. Isolamento, ativação e expansão de células T baseadas em flutuação de amostras de células mononucleares do sangue periférico humano usando microbolhas. J. Vis. (2022)

Este vídeo demonstra o isolamento de células T de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) usando a tecnologia de classificação de células ativadas por flutuabilidade funcionalizada (BACS). A técnica de isolamento envolve a seleção positiva de células T CD3 +, marcando as células com anticorpos anti-CD3 biotinilados e separando as células ligadas a anticorpos usando microbolhas ligadas à estreptavidina.

Protocolo

1. Isolamento de células T com microbolhas usando seleção positiva

NOTA: Este protocolo detalha uma abordagem de seleção positiva CD3⁺ em pequena escala usando SAMBs.

1. Incubar 3 x 10⁸ PBMCs obtidos comercialmente em 2,5 mL de tampão de separação com anticorpo anti-CD3 biotinilado (OKT3) a uma concentração de 25 ng de anticorpo por 1 milhão de células (25 ng / M). Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo e incube em temperatura ambiente por 10 min.
2. Adicione microbolhas de estreptavidina (SAMBs) na proporção de 0,5 (quantidade de SAMB):1 (quantidade de células) de acordo com a concentração de SAMB relatada pelo fabricante.
3. Misture usando um rotador comercial de ponta a ponta (EOE) a 20 rpm por 10-15 min em temperatura ambiente. Centrifugue por 5 min a 400 x g em temperatura ambiente.
4. Após a centrifugação, as células selecionadas positivamente estarão no topo da suspensão com os SAMBs. As células não selecionadas restantes estarão no pellet de célula na parte inferior do tubo. Usando uma pipeta de vidro de 9 polegadas, insira a ponta abaixo da camada de célula de bolha no fundo do tubo, aspire o pellet celular e o sobrenadante com uma pipeta eletrônica e transfira-os para um novo tubo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-CD3 humano (OKT3) de biotina	Biolenda	Rolamento 317320
Leucopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
PBMCs humanos normais	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Kit de microbolhas de estreptavidina (inclui o tampão de separação da Akadeum)	Akadeum	11110-000