Cultura de células T ativadas de células mononucleares do sangue periférico humano

Resumo

Fonte: Mølgaard, K., et al. Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas. J. Vis. Exp. (2021).

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para ativação de células T primárias humanas. A incubação de células T virgens com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, seguida de tratamento com interleucina-2 ou interleucina-15, leva à ativação de células T virgens e sua diferenciação e proliferação em células T efetoras ou de memória.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Cultura de linfócitos T primários humanos ativados

1. Descongelamento de células (Dia 1)
   1. Pré-aqueça 10 mL de RPMI 1640 por amostra a cerca de 37 °C.
   2. Pegue o número desejado de ampolas de células mononucleares do sangue periférico e armazene-as temporariamente em gelo seco.
   3. Ressuspenda as células congeladas em 10 mL de RPMI 1640 pré-aquecido.
   4. Centrifugue as células por 5 min a 500 x g em RT.
   5. Rejeitar o sobrenadante e lavar novamente as células ressuspendendo em 10 ml de RPMI 1640 e centrifugando como descrito no ponto 1.1.4.
   6. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células a 2 x 10⁶ células por ml de meio X-VIVO 15 + 5% de soro humano (doravante: meio de células T).
   7. Colocar 2 ml de células por alvéolo numa placa de cultura de células de 24 poços e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Ativação de células (Dia 0)
   1. Lave os grânulos CD3 / CD28 transferindo 12,5 μL de grânulos por 1 milhão de células para um tubo de microcentrífuga. Adicione 12,5 μL de PBS por 12,5 μL de contas.
      nota: É importante vórtice o frasco de grânulos antes de usar.
   2. Coloque o tubo da microcentrífuga em um ímã adequado por 1 min.
   3. Descarte o tampão e ressuspenda os grânulos no volume original do meio de células T (12,5 μL de meio de células T por 12,5 μL do volume original de grânulos).
   4. Adicione 12,5 μL de grânulos por milhão de células correspondendo a uma proporção de 1:2 (grânulos: células).
   5. Divida as células em duas condições com cerca de 5 milhões de células em cada uma.
   6. Adicione o volume correto de citocinas às condições mencionadas na Tabela 1.
   7. Incubar as células durante 3 dias a 37 °C e 5% de CO₂.
3. Cultura de células (dias 3 e 5)
   1. Ressuspenda as células e divida-as transferindo metade do volume de cada poço para um novo poço. Adicione o mesmo volume de meio de células T frescas a cada poço.
   2. Adicione novas citocinas a cada condição, conforme mencionado na Tabela 1.

	Citocina	estoque	Fator de diluição	final
Condição 1	IL-2	3 x 106 U/mL	30.000	100 U/mL
Condição 2	IL-15	2 x 105 U/mL	2.000	100 U/mL

Tabela 1: Preparação de culturas de citocinas usadas para guiar alterações metabólicas em células T.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de tecidos com 24 poços	Nunc	142485
Grânulos anti-CD3xCD28	Gibco	11161D
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
Soro Humano	Sigma Aldrich	H4522	Calor inativado a 56 °C por 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Linfoprep	Tecnologias de células-tronco	Pedido 7801
Pbs	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Ímã de contas de células T DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D