Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento de célula única do PDLN
- Coloque uma malha metálica estéril de 250 μm sobre um tubo cónico de 15 ml num rack. Enxágue a malha com 1 mL de RPMI.
- Transfira os gânglios linfáticos para a malha de metal e triture-os através da malha usando uma pinça. Aplique 1 mL de RPMI na malha de metal para lavar as células no tubo. Repita mais 3 vezes e remova a malha.
- Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em aproximadamente 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.
- Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em aproximadamente 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.
- Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 2 mL de RPMI. Transfira 2 mL da suspensão celular para tubos inferiores redondos de 5 mL com tampas de filtro de célula. Aplique a suspensão celular nas tampas do filtro de células.
2. Citometria de fluxo
- Centrifugar as suspensões celulares de PDLN a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Corar as células com os seguintes anticorpos de superfície em 100 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo (tampão FACS): 0,75 μg/100 μL de anticorpo CD4 conjugado com FITC, 0,60 μg/100 μL de anticorpo CD8 conjugado com APC-H7, 0,30 μg/100 μL de anticorpo CD25 conjugado com PE, 5 μL (1: 20) de anticorpo Nrp1 conjugado com APC. Incube os tubos no gelo por 40 min.
- Adicione 200 μL de tampão FACS a cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante. Repita mais uma vez.
- Fixe e permeabilize as células ressuspendendo o pellet celular em 500 μL de tampão de fixação de permeabilização (PFB).
nota: O PFB é preparado misturando 1 parte de Concentrado de Fixação/Permeabilização com 3 partes de Diluente de Fixação/Permeabilização.
- Mantenha os tubos na geladeira a 4 °C durante a noite.
nota: Uma incubação de 1 h também funciona.
- Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão de lavagem de permeabilização (PWB). Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
nota: O PWB é preparado diluindo o tampão de permeabilização (10x) a 1:10 em água destilada.
- Cor as células com os seguintes anticorpos intracelulares em 100 μL de PWB: 0,30 μg/100 μL de anticorpo Foxp3 conjugado com PE-Cy7, 4 μL (1: 25) de anticorpo Helios conjugado com PacificBlue. Incube os tubos no gelo por 1 h.
- Adicione 500 μL de PWB a cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de PWB. Centrifugar os tubos a 433 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 300 μL de tampão FACS.
- Analise as células em um citômetro de fluxo.
- Bloqueie as células individuais com base na área de dispersão lateral, altura e largura e área de dispersão direta, altura e largura. Execute um milhão de eventos para análise.
- Exporte os arquivos FCS dos experimentos e analise-os usando o software analisador de citometria de fluxo.
