Isolamento de leucócitos hepáticos marginais de fígado de camundongo

Resumo

Fonte: Sorski, L., et al. Colheita seletiva de leucócitos hepáticos marginais. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de leucócitos hepáticos marginais do fígado de camundongo por perfusão forçada.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Protocolo do mouse

1. Perfusão do fígado e coleta de leucócitos MH
   1. Eutanásia do animal com uma overdose de 8% de isoflurano. Como precaução, coloque um tubo de 15 ml contendo uma almofada embebida em isoflurano ao redor da cabeça do camundongo até abrir sua cavidade torácica.
   2. Fixe os membros do mouse em uma cama.
   3. Abra as cavidades peritoneal e torácica para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração, mantendo o aspecto inferior do diafragma intacto (para criar uma piscina de drenagem da cavidade torácica). Evite sangrar durante este processo.
      1. Especificamente, inicie a incisão no ponto da linha média abdominal inferior, sem danificar os órgãos internos, e progrida para ambos os lados diagonalmente em direção às costelas, cortando-as até os níveis superiores da cavidade torácica.
   4. Retire os intestinos e coloque-os fora do animal à direita do experimentador, para expor a veia porta.
   5. Insira uma agulha de 30 g, conectada a uma bomba peristáltica, na veia porta rostral à veia esplênica.
   6. Corte a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e coleta do perfusato da cavidade torácica.
   7. Ligue a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml/min e colete suavemente os primeiros 3 ml de perfusato contaminados com sangue da piscina da cavidade torácica.
   8. Descarte este perfusate. Repita essa lavagem novamente, se necessário, usando solução salina, e só então comece a coletar o perfusato hepático.
   9. Reinicie a perfusão a uma velocidade de até 4 ml/min e colete 10 ml de perfusato da cavidade torácica usando uma borboleta conectada a uma seringa.
   10. Termine a perfusão quando a cor do fígado ficar marrom claro.

2. Extração de leucócitos

1. Centrifugue o perfusato por 10 min a 400 x g.
2. Aspire o sobrenadante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba peristáltica Autoclud
Agulha borboleta	OH MEU DEUS		26G
Agulha borboleta	OH MEU DEUS		21G * 3/4 "
seringa	Solução Pic		1 ml
seringa	Solução Pic		2,5 ml
seringa	Solução Pic		5 ml
seringa	Solução Pic		10 ml
seringa	Solução Pic		25 ml
Pinça de bordas rombas
tesoura
hemostato
Pinça de tecido