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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Diferenciação de megacariócitos
- Semeie 5 × 10células de 5 células/mL de células CD34+ em 2 mL de SFM suplementado com 50 ng/mL de trombopoietina humana recombinante (rhTPO) por poço em uma placa de 12 poços. Incubar células a 37 °C, 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada. Se as células forem confluentes antes de serem necessárias para análise, colha as células e divida-as em vários poços com meio fresco e rhTPO.
nota: Dois ou três poços devem ser preparados especificamente para monitorar a diferenciação em diferentes momentos (por exemplo, dias 7, 9 e 10).
- Colha células dos poços reservados para monitorar a diferenciação sem perturbar as células nos outros poços.
- Células coradas com 20 μL de anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC e 10 μL de anticorpo anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 em um volume final de 100 μL. Configure um tubo de controle usando os respectivos anticorpos de controle de isotipo. Incubar durante 15 - 30 min a 4 °C.
- Adicione 1 mL de SB para lavar. Centrifugue a 400 × g por 10 min. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 - 300 μL de SB. Analisar por citometria de fluxo.
- Para cada fluoróforo, analise os controles de isotipo para definir o gating para populações positivas FITC e Alexa Flour 647. Analise as amostras de células coradas para determinar a porcentagem de células CD41 + / CD42a + duplamente positivas, que representam MK maduras ( Figura 1C ).
- Para visualização microscópica de marcadores de superfície celular, core as células conforme descrito em 1.3.
- Adicione 1 mL de SB para lavar. Centrifugue a 400 × g por 10 min. Ressuspenda o pellet em 100 μL de SB e gire em uma lâmina de vidro a 1.000 x g por 5 min. Fixe as células na lâmina mergulhando-as em metanol por 30 s. Seque ao ar, adicione 20 μL de mídia de montagem contendo DAPI (consulte a Tabela de Materiais), cubra com uma lamínula e visualize usando um microscópio fluorescente (Figura 2A).
- Para visualização de antígenos intracelulares, ressuspenda as células em PBS e fixe com paraformaldeído (concentração final de 1%) por 15 min à temperatura ambiente. Para permeabilizar as células, adicione triton-X 100 (0,1%) e incube por 15 min. Lave as células com 2 mL de PBS / 0,1% triton-X 100. Ressuspenda em 100 μL de PBS / 0,1% triton-X 100, adicione anticorpos anti-vWf e anti-CD62p (diluição 1:200) e incube por 30 min em temperatura ambiente.
- Lave com 2 mL de PBS / 0,1% de triton-X 100 e centrifugue a 400 × g por 10 min, ressuspenda em 100 μL do mesmo tampão e adicione IgG-Alexa 594 anti-mouse e IgG-Alexa 488 anti-coelho (1:100). Incubar por 30 min em temperatura ambiente, lavar com 2 mL de PBS / 0,1% de triton-X 100, ressuspender em 100 μL do mesmo tampão e adicionar 20 μL de anti-CD42b-APC. Em seguida, gire as células em lâminas de vidro conforme descrito na etapa 1.6.1 e prepare amostras para visualização microscópica conforme descrito na etapa 1.6.1.
- Para a determinação da ploidia, colher células nos dias 12 ou 13 de diferenciação. Adicione 1 mL de SB para lavar. Centrifugue a 400 × g por 10 min e cove com 20 μL de anticorpo anti-GPIIb/CD41-FITC em um volume final de 100 μL. Incube a 4 °C por 30 min.
- Lave uma vez com 1 mL de SB e ressuspenda o pellet em 300 μL de tampão citrato hipotônico (1,25 mM de citrato de sódio, 2,5 mM de cloreto de sódio, 3,5 mM de dextrose) contendo 20 μg / ml de iodeto de propídio e 0,05% de Triton-X 100. Incubar durante 15 min a 4 °C protegido da luz.
- Adicionar RNase a uma concentração final de 20 μg/ml e incubar durante 30 min a 4 °C protegido da luz. Determine a intensidade do iodeto de propídio por citometria de fluxo coletando de 30.000 a 50.000 eventos da população CD41-FITC + (Figura 2C).
2. Contagem de plaquetas, enumeração de plaquetas e ativação plaquetária
- Colha células (da etapa 1.1) nos dias 8 ou 9 de diferenciação e semeie a 1 × 104 células/poço em placas de 48 poços em 200 μL de SFM fresco suplementado com 50 ng/mL de rhTPO. Cultura por 5 dias a 37 °C, 5% CO2,
nota: Para fins de quantificação, semeie poços em triplicata. Essa baixa densidade é necessária para visualização e contagem de MK portador de plaquetas. As plaquetas geralmente começam a aparecer após 2 dias de cultura. O pico é entre os dias 4 e 5.
- Conte o número de MK com plaquetas em todo o poço em um microscópio de luz invertida usando objetivas de 10X ou 20X.
nota: Um estágio de microscópio aquecido (37 ° C) é preferível, pois manter as células em temperatura ambiente por longos períodos causa encolhimento das extensões de plaquetas. As plaquetas são observadas como longas extensões do corpo MK. Cada MK pode ter várias protrusões plaquetárias. À medida que as plaquetas se desenvolvem, o corpo do MK diminui de tamanho.
- Colha as células e centrifugue a 400 x g por 10 min em temperatura ambiente. Células coradas com 20 μL de anticorpo anti-CD41-FITC humano, conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Calcule a porcentagem de MK com plaquetas (pbMK):
pbMK (%) = [(MKs com proplaquetas/poço) / (Total de células CD41+/poço)] x 100
- Para contar as plaquetas liberadas no meio de cultura, misture suavemente as células com uma pipeta Pasteur e colete 100 μL nos dias 14 ou 15 de cultura.
- Corar com 20 μL de anticorpo anti-CD41-FITC humano por 20 a 30 min a 4 °C. Montar um tubo de controle usando o respectivo anticorpo de controle de isotipo.
- Adicione 150 μL de SB e 50 μL de contas de contagem.
- Para análise de citometria de fluxo, defina o FSC e o SSC para escala logarítmica. Use plaquetas sanguíneas humanas normais de plasma rico em plaquetas coradas com CD41-FITC, conforme descrito na seção 2.4.1, para definir o gating para plaquetas (Figura 3A).
- Analise as plaquetas coradas contando grânulos por citometria de fluxo. Colete 1.000 eventos de contagem de contas usando o gráfico de dispersão FSC versus SSC (Figura 3A). Calcule o número de plaquetas com base nos eventos positivos para CD41-FITC (Figura 3B) usando a fórmula:
Plaquetas por μL=[(número de eventos positivos para CD41-FITC)/1.000 grânulos)] x [(número de grânulos em 50 μL)/volume de amostra)]
- Para analisar a ativação plaquetária, misture suavemente as células com uma pipeta Pasteur e colete 100 μL nos dias 14 ou 15 de cultura. Adicione 1 mL de tampão de Tyrode (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glicose, pH 6,5) e centrifugue a 200 x g por 5 min para pellet células.
- Colete o sobrenadante e centrifugue a 800 x g por 10 min para granular partículas do tamanho de plaquetas.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 100 μL de tampão de Tyrode. Adicionar 20 μL de anticorpo PAC1-FITC e difosfato de adenosina (ADP) a uma concentração final de 20 μM. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Analisar por citometria de fluxo para determinar a percentagem de acontecimentos positivos para FITC. Utilizar plaquetas humanas frescas tratadas da mesma forma que um controlo positivo (figura 3C).
