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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. 3D Cultura de órgãos tímicos para gerar iTE
- Colha lobos tímicos fetais de camundongos e implante linfócitos endógenos por tratamento com desoxiguanosina (dGUO).
- No dia 7 do tratamento com dGOO, pegue quatro novos pratos de 10 cm e encha cada um com 20 mL de meio completo (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-alanil-L-glutamina + 1x piruvato de sódio + 1x meio essencial mínimo com aminoácidos não essenciais (MEM-NEAA) + 1x penicilina-estreptomicina + [1:1000] 2-mercapto etanol).
- Transfira todas as membranas de nitrocelulose com lóbulos tímicos para um prato de 10 cm. Separe os lóbulos individuais da membrana com uma pinça, permitindo que sejam submersos no meio. Descarte as membranas. Incubar por 1 h em RT.
- Transferir os lóbulos tímicos para uma nova placa de 10 cm com meio completo e incubar durante 1 h em RT. Repetir este passo mais 2 vezes.
- Usando uma pinça, fixe os lobos tímicos ao prato (um de cada vez) e, com a outra mão, faça uma incisão profunda de 100 a 200 μm no centro e estenda metade do diâmetro do lobo para facilitar a migração do progenitor das células T para o lobo.
- Transfira os lobos tímicos para uma nova placa de 10 cm preenchida com meios de diferenciação completos (meio completo + 5 ng/mL de interleucina-7 de camundongo (IL-7) + 5 ng/mL de ligante Flt3 de camundongo (FLT3L) + 5 ng/mL de fator de células-tronco (SCF)).
- Opcionalmente, se estiver usando placas de cultura 3D com grades de nível inferior e superior, preencha ambas as grades com PBS estéril para evitar a evaporação e secagem das gotas penduradas.
- Transfira 30 μL de meio completo contendo um lobo tímico tratado com dGuo da etapa 1.6 para cada poço da placa de cultura 3D.
- Colete células de linhagem T não aderentes (células T imaturas derivadas de iPSC) da co-cultura OP9 / DLL1 (dias 16-21) e ressuspenda em 2–5 x 103 células de linhagem T por meio de 20 μL.
- Adicione 20 μL de suspensão de células de linhagem T a cada lobo tímico na placa de cultura 3D. Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
- Defina a pipeta P200 para 30 μL e aspire o meio após pipetar várias vezes de cada poço para remover todas as células ao redor dos lobos tímicos. Descarte a mídia e adicione 30 μL de mídia completa. Repita este procedimento 5 a 7 vezes para remover quaisquer células T imaturas extras que não migrem para os lobos. Altere 25–30 μL de mídia diariamente a partir de então.
- Confirme a formação de um halo de emigrantes tímicos derivados de iPSC (iTE) ao redor dos lobos começando nos dias 4-5 por microscopia de luz.
- Colete iTE diariamente pipetando o meio sem ruptura do lóbulo. Troque de mídia todos os dias e continue a coleta por até aproximadamente 12 dias.
- Os iTE colhidos estão prontos para uso em análises moleculares (Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4) ou experimentos de transplante in vivo.
