Expansão ex vivo de células assassinas naturais de células mononucleares do sangue periférico

Resumo

Fonte: Ma, M., et al. Método de expansão de células Natural Killer (NK) e CAR-NK usando linha de células B modificadas por IL-21 ligadas à membrana. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra uma técnica para a expansão de células natural killer (NK) diretamente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) usando uma linhagem de células alimentadoras. As PBMCs são co-cultivadas com células alimentadoras linfoblastóides geneticamente modificadas que expressam interleucina-21 ligada à membrana (mIL-21), e a cultura é suplementada com as citocinas interleucina-2 (IL-2) e interleucina-15 (IL-15). Juntos, esse coquetel de ligantes leva à expansão prolongada das células NK com alta pureza.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Expansão de células NK dos tecidos hepáticos (Dia 0), conforme mostrado na Figura 1.

NOTA: O número inicial de células e a viabilidade estão fortemente correlacionados com o tempo desde a remoção do órgão e a quantidade inicial de amostra de tecido. No entanto, se os tecidos forem colocados em 30 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) e ....

Resultados

Figura 1: Diagrama da expansão das células NK a partir de amostras sólidas de órgãos humanos. Resumidamente, as amostras de fígado humano obtidas são picadas em pequenos cubos para digestão mecânica. As células dissociadas são então isoladas usando sílica revestida com PVP e meios de separação de linfócitos. Além disso, as células NK são expandidas usando o protocolo de expansão descrito na F.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa G-REX de 6 poços	Wilson Wolf	80240M	Para expansão de células NK
Fragmento AffiniPure F(ab')2 conjugado com AF647 de cabra anti-humano IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	109-606-088	Para citometria de fluxo
Colagenase IV	sigma	C4-22-1G	Para isolamento de TILs
Meios de criopreservação	Corning	35-010-CV	90% de sucesso
Ingrediente: Soro Fetal Bovino (FBS)
Meios de criopreservação	sigma	D2050	10% de sucesso
Ingrediente: Dimetilsulfóxido (DMSO)
Tubos C gentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-237	Para isolamento de TILs
gentleMACS Octo	Miltenyi Biotec	citação	Para isolamento de TILs
Solução salina balanceada de Hank (HBSS - sem cálcio ou magnésio)	ThermoFisher	14170120	Para isolamento de TILs
IL-15 humana	Peprotech	200-15	Para expansão de células NK
IL-2 humana	Peprotech	200-02	Para expansão de células NK
Células alimentadoras de 221 mIL21 irradiadas	Gerado no laboratório do Dr. Dongfang Liu		Congelado em meio criopreservado
Meios de separação de linfócitos	Corning	25-072-CV	Para isolamento de TILs
Clone anti-humano HIT3a do CD3 do PE	Biolenda	300308	Para citometria de fluxo
PE / Cy7 anti-clone CD56 humano (NCAM) 5.1H11	BioLegend	362509	Para citometria de fluxo
Percoll	GE Saúde	17089101	Para isolamento de TILs
Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)	Centro de Sangue de Nova York		Isolado do plasma de doadores saudáveis, congelado em meio criopreserve
Mídia R-10	VWR	Rolamento 45000-404
Ingredientes: RPMI 1640
Mídia R-10	VWR	Rolamento 45000-304	1% de sucesso
Ingrediente: L-glutamina
Mídia R-10	VWR	Rolamento 45000-652	1% de sucesso
Ingrediente: Estreptomicina da penicilina
Mídia R-10	Corning	35-010-CV	10% de sucesso
Ingrediente: Soro Fetal Bovino (FBS)
Azul Trypan	Corning	25-900-Cl	Para contagem de células