Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Expansão de células NK dos tecidos hepáticos (Dia 0), conforme mostrado na Figura 1.
NOTA: O número inicial de células e a viabilidade estão fortemente correlacionados com o tempo desde a remoção do órgão e a quantidade inicial de amostra de tecido. No entanto, se os tecidos forem colocados em 30 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) e mantidos no gelo ou na geladeira a 4 ° C durante a noite, as células NK ainda podem ser expandidas em alta pureza e viabilidade até 24 h depois.
- Identifique áreas de tecido viáveis para obter linfócitos de tecidos e seções usando equipamento cirúrgico estéril.
- Coloque os lenços em 30 mL de HBSS (sem cálcio ou magnésio) e mantenha no gelo até que esteja pronto para se preparar para o isolamento.
- Pique o tecido em cubos de <0,5 cm usando lâminas de barbear estéreis ou tesouras e pinças dentro de um armário de biossegurança.
- Prepare uma solução de colagenase IV 1x (1 mg / mL) diluindo um estoque de 10x em HBSS (10x colagenase IV: 10 mg / mL ou ~ 200 U / mL).
- Coloque os pedaços de tecido picados nos tubos dissociadores de tecido. Encha os tubos com no máximo 4 g de tecido e mergulhe os pedaços de tecido em ~ 10 mL de colagenase 1x IV.
nota: O uso de DNase I não é recomendado, pois pode diminuir ligeiramente a viabilidade e o rendimento do NK. Consulte a Tabela de Materiais para obter os tubos dissociadores de tecidos específicos usados.
- Coloque os tubos dissociadores de tecido em um dissociador de tecido e misture a 37 °C para picar bem o tecido.
nota: Para o tecido hepático, isso pode levar mais de 30 minutos. Para tecidos mais friáveis, cerca de 15 minutos podem ser suficientes. Consulte a Tabela de Materiais para tubos dissociadores de tecidos específicos e o dissociador de tecidos usado.
- Remova os tubos dissociadores de tecido e triture através de um filtro de células de nylon de 40 μm usando a extremidade traseira de uma seringa de 5 mL. Colete o eluente e descarte os grandes fragmentos não digeridos.
- Gire o eluente a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante.
- Ressuspenda os grânulos celulares em sílica revestida com polivinilpirrolidona (PVP) a 30% para remover as células de gordura que, de outra forma, contaminariam a fração final de linfócitos.
- Para preparar 1x sílica revestida com PVP, use diluição 9:1 de sílica revestida com PVP em 10x PBS.
nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter a sílica revestida com PVP específica usada.
- Para preparar 30% de sílica revestida com PVP, dilua 1x sílica revestida com PVP com PBS/HBSS.
- Gire o pellet celular a 400 x g por 5 min em temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 9 mL de meio R-10.
nota: Consulte a Tabela de Materiais para a composição do meio R-10
- Coloque cuidadosamente a suspensão celular em camadas sobre 4 mL de Ficoll ou meio de separação de linfócitos para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos e das células polimorfonucleares.
- Separe as camadas centrifugando a 400 x g durante 23 min à temperatura ambiente com a aceleração e os travões desligados ou na posição mais baixa. Decantar cuidadosamente a camada média superior e colher a interfase que contém linfócitos infiltrantes de tecidos.
- Enxágue as células com 10 mL de meio e prossiga para a contagem de células, citometria de fluxo, alíquota e congelamento de células ou protocolo de expansão NK primária.
2. Expansão primária de células NK de PBMCs (ou CB ou tecidos de órgãos) (Dia 0), conforme mostrado na Figura 2.
- Descongelar o PBMC congelado e as células alimentadoras congeladas e irradiadas em banho-maria a 37 °C.
- Lave o PBMC e 100 células de 221 mIL-21 irradiadas com gama (irradiadas com Gy) por centrifugação a 400 x g por 5 min com 10 mL de meio R-10 separadamente.
- Economize 1 x 106 células de PBMC para citometria de fluxo.
nota: A pureza inicial da célula NK é um fator importante no cálculo da taxa de expansão da célula NK.
- Ressuspenda as células em 1 mL de meio R-10. Conte as células usando Trypan Blue.
- Misture 5 x 106 células de PBMC com 10 x 106 células de 100 células 221-mIL-21 irradiadas com Gy em uma placa especial de 6 poços (ver Tabela de Materiais).
- Adicione 30 mL de meio R-10 suplementado com IL-2 humana (200 U / mL) e IL-15 humana (5 ng / mL) (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a placa especial de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2.
- Substitua o meio por meio R-10 suplementado com IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) para manter as células NK a cada 3-4 dias.
nota: Mantenha menos de 20 x 106 células por poço para expansão adicional a cada mudança de meio. Para obter a melhor viabilidade, certifique-se de que o número total de células em cada poço não exceda 100 x 106 células.
- Registre o número total de células, a viabilidade e realize a citometria de fluxo a cada 3-4 dias para calcular a taxa de expansão das células NK.
