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1. Preparação de lâminas para aderir células Raji
- Adicione 150 μL de fibronectina (100 μg / mL) por poço a uma lâmina de câmara de 8 micropoços (lâmina de câmara de fundo de plástico) e incube-a por 30 min a 1 h a 37 ° C. Este substrato de adesão permitirá a ligação das células Raji ao fundo do poço (Etapa 2), a formação de conjugados vivos com células Jurkat (Etapa 4) e a captura de microscopia de lapso de tempo (etapa 6), e também é compatível posteriormente com a fixação opcional de paraformaldeído (PFA).
NOTA: Para fixação de acetona, use lâminas de câmara de fundo de vidro e poli-L-lisina (20 μg/mL) em vez de fibronectina, pois a acetona dissolve o plástico. A lâmina de câmara de 8 micropoços (1 cm2 poços, volume máximo de 300 μL) ou equivalente é um formato flexível e apropriado.
- Aspire a fibronectina usando uma pipeta automática de 200 μL e lave cada poço com 200 μL de PBS por 2 min com agitação suave. Repita esta lavagem mais uma vez. A lâmina da câmara pode ser armazenada nesta fase com PBS durante 1-2 semanas a 4 °C.
2. Adesão de células Raji às lâminas da câmara e marcação de 7-amino-4-clorometilcumarina (CMAC)
- Transfira 10 mL de uma pré-cultura confluente (1-2 x 106 células/mL) de células Raji para um tubo de fundo em V de 15 mL. Misture bem e use 10 μL para contar as células na câmara de Neubauer ou equivalente.
- Centrifugue as células restantes a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente. Aspire e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda suavemente o pellet celular em um meio de cultura completo quente (RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina) a uma concentração de 106 células / mL. Use a equação abaixo:
([ ]inicial x Vinicial = [ ]final x Vfinal), onde [ ]inicial representa a concentração inicial da célula, Vinicial = volume inicial da suspensão celular, [ ]final = concentração final da célula, Vfinal = volume final da suspensão celular.
NOTA: Dependendo da concentração celular da cultura inicial, é possível coletar mais células do que o necessário, mas é importante manter as células restantes em cultura (37 °C) até o final do experimento para evitar possíveis problemas (consulte a Etapa 2.6).
- Rotule as células Raji para permitir sua identificação durante a formação do conjugado sináptico. Neste experimento, a marcação de 7-amino-4-clorometilcumarina (CMAC) é realizada na etapa 2.4.2.
- Transfira o número necessário de células Raji no meio de cultura para um tubo de 2 ml. Para as lâminas de câmara de 8 micropoços, é necessário um total de 1,6 mL da suspensão celular (200 μL por poço).
- Adicione CMAC a uma concentração final de 10 μM. Mantenha as células no escuro cobrindo o tubo com papel alumínio, pois o CMAC é sensível à luz. 200 μL contendo 2 x 105 células Raji são necessárias por 1 cm2 poço. Assim, se 8 poços precisam ser preparados, 1,6 x 106 células Raji são necessárias.
NOTA: A marcação de células Raji com rastreador de células em azul (CMAC, excitação UV e emissão azul) as distingue das células Th quando os conjugados sinápticos são formados. Este corante é compatível com fixadores de PFA e acetona e permite outros procedimentos de imunofluorescência. Tente evitar a exposição à luz. A marcação das células Raji em um pool com CMAC seguida de ressuspensão antes da adesão das células Raji às lâminas da câmara revestidas com fibronectina garante a marcação homogênea das células Raji com CMAC entre diferentes poços.
- Ressuspenda as células coradas com CMAC e, após a aspiração do PBS na lâmina da câmara da etapa 1.2, transfira 200 μL da suspensão celular para cada poço das lâminas da câmara revestidas com fibronectina preparadas nas etapas 1.1-1.2. Incubar a lâmina da câmara a 37 °C, 5% de CO2 por 30 min-1 h.
NOTA: A adesão e a rotulagem CMAC ocorrerão simultaneamente nesta etapa e isso economiza tempo. Esteja ciente de que as células Raji sedimentam rapidamente e é preciso tomar cuidado para manter uma concentração homogênea na suspensão celular antes da semeadura. Não é necessário lavar o CMAC nesta fase por centrifugação, pois a lavagem do CMAC será feita mais facilmente na etapa 2.7 (quando as células Raji marcadas já aderiram às lâminas da câmara). Como o CMAC está presente na suspensão celular em grande excesso, o fundo de fluorescência azul é muito alto para distinguir as células coradas de azul. Verifique a fluorescência CMAC da célula na etapa 2.7 após a lavagem do CMAC.
- Certifique-se de que as células Raji estejam aderidas ao fundo dos poços agitando suavemente as lâminas da câmara no microscópio. Certifique-se de que as células exibam lacunas entre si e não sejam confluentes (Figura 1, painel do meio). 50-60% da confluência celular é apropriada.
- Se a maioria das células aderir eficientemente à lâmina da câmara e nenhuma lacuna celular for observada, lave cada poço com um meio completo quente e ressuspenda o meio com uma pipeta automática de 200 μL para separar o excesso de células. Verifique a confluência após cada etapa de ressuspensão.
- Se as células não aderirem, repita a etapa de adesão novamente e aumente o tempo de adesão e/ou o número de células.
NOTA: É possível parar aqui, incubar a lâmina da câmara a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite (O/N) e continuar com o protocolo no dia seguinte. Confirme no dia seguinte se as células Raji permanecem aderidas e marcadas com CMAC usando microscopia de fluorescência.
- Lave cada poço novamente cuidadosamente com RPMI suplementado a quente para eliminar o excesso de CMAC e verifique se há emissão de azul com o microscópio de fluorescência (Figura 1).
NOTA: Para evitar o uso de óleo de imersão (pegajoso e viscoso) e objetivas de óleo de alta abertura numérica, objetivas de distância extra longa (ou seja, 20x ou 40x) podem ser usadas para verificar rapidamente a rotulagem CMAC usando o microscópio de fluorescência.
3. Pulso de CMAC - Células Raji Marcadas com Enterotoxina E Estafilocócica
- Adicione a enterotoxina estafilocócica E (SEE, 1 μg / mL) a cada poço. O SEE pode ser convenientemente diluído em um meio de cultura celular (solução de trabalho a 100 μg / mL) dos estoques congelados de SEE (1 mg / mL em PBS). Use 2 μL da solução de trabalho 100x por micropoço de 200 μL.
CUIDADO: Use luvas para esta etapa e descarte a ponta usada na caixa de risco biológico.
- Incubar a lâmina da câmara a 37 °C, 5% de CO2 durante pelo menos 30 min. O efeito SEE dura pelo menos 3-4 h.
NOTA: O SEE pode ser adicionado aos poços em diferentes pontos de tempo quando necessário se configurações distintas de lapso de tempo forem planejadas (etapa 5) e/ou dependendo do ponto de tempo inicial para os experimentos de ponto final (etapa 6).
4. Preparação de células Jurkat
- Use uma cultura de células Jurkat previamente cultivadas (1-2 x 106 células / mL) para este experimento. Use células de um frasco de cultura padrão ou de uma transfecção anterior seguindo protocolos de eletroporação padrão, conforme descrito anteriormente. A transfecção de células de Jurkat permitirá a visualização em time-lapse do tráfego de grânulos secretores em células vivas. Por exemplo, quando GFP-CD63 (um marcador de MVB) é expresso, o movimento de vesículas decoradas com GFP-CD63 pode ser registrado.
- Observe as células sob um microscópio de contraste de fase. Se for observado um excesso de células mortas (>20-30%), realize a centrifugação do gradiente de densidade de Ficoll usando protocolos padrão, para eliminar o excesso de células mortas (as células mortas exibem maior densidade do que as células vivas) antes do uso (ver Discussão).
- Transfira as células para um tubo de 15 mL, tubo com fundo em V e use 10 μL para contagem usando um hemocitômetro.
- Centrifugue as células restantes conforme descrito na etapa 2.2. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células na mesma concentração que as células Raji (1 x 106/ml) utilizando um meio de cultura fresco e quente. Siga as etapas 2.2-2.3.
- Mantenha as células de Jurkat em cultura (37 °C, 5% CO2) enquanto aguarda a Etapa 4.
NOTA: Na segunda opção (transfecção), o número de células vivas será muito menor do que na primeira. Assim, considere usar um volume de cultura de células inicial maior para ter células suficientes para o experimento. De 10 x 106 células de Jurkat por cubeta de eletroporação e transfecção, apenas 2-4 x 106 células de Jurkat sobreviverão após 48 h de transfecção e algumas dessas células serão perdidas durante a etapa de Ficoll. Assim, uma cubeta de eletroporação é geralmente suficiente para desafiar as células Raji pulsadas por SEE aderidas de 8 micropoços (1,6 x 106 células Jurkat transfectadas necessárias).
5. Co-semeadura de células Raji e Jurkat
- Retire as lâminas da câmara contendo as células Raji marcadas com CMAC, pulsadas e aderidas para fora da incubadora da etapa 3.2. Não é necessário lavar o CMAC nesta fase, pois isso foi feito anteriormente na Etapa 2.7.
- Aspirar cuidadosamente o meio de cultura de cada poço, um a um, de um canto do poço usando uma pipeta automática de 200 μL. Não deixe o meio no poço secar completamente.
- Substitua imediatamente o meio por 200 μL de células Jurkat ressuspensas em meio de cultura celular (1 x 106 / mL) preparado na etapa 4.5. Se a imagem de lapso de tempo for realizada, vá para a etapa 6 imediatamente após esta etapa, pois as células de Jurkat tendem a sedimentar e formar conjugados sinápticos muito rapidamente. Por conveniência, os micropoços contendo células Raji aderidas e pulsadas por SEE que não recebem semeadura com células Jurkat neste estágio devem ser mantidos com um meio de cultura celular até o desafio subsequente com células Jurkat. Isso permitirá de forma flexível desafios subsequentes com células Jurkat para abordagens experimentais adicionais de lapso de tempo ou cinética reversa, ponto final.
- Se um lapso de tempo for executado, prossiga rapidamente para a etapa 6. Isso envolve a co-cultura por 1-2 h na incubadora de estágio de microscópio ou equivalente a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir a formação de conjugados sinápticos e aquisição simultânea de imagens. Se estiver prevista uma análise do ponto final, mas sem lapso de tempo, verificar a formação do conjugado após o período de co-cultura utilizando o microscópio (como na figura 1) antes de fixar as células.
6. Imagem de lapso de tempo de conjugados sinápticos emergentes
- Prepare o microscópio e a câmara de incubação antes da imagem. Para o exemplo, as configurações detalhadas de microscopia são mostradas na Figura 2.
NOTA: Se um experimento de lapso de tempo for planejado, todas as configurações e complementos do microscópio (câmara de cultura de células ambiente, etc.) devem ser preparados antes de adicionar a suspensão Jurkat à lâmina da câmara com células Raji aderidas. As etapas a seguir são descritas para um microscópio comercial (Tabela de Materiais). No entanto, qualquer microscópio de fluorescência invertida equipado com uma incubadora de cultura de células pode ser usado.
- Use um microscópio com imersão em óleo de 60x e alta abertura numérica ao criar imagens de tráfego polarizado.
- Certifique-se de que o sistema de foco automático esteja ligado e ajuste o deslocamento para focar as células Raji ligadas à superfície inferior. Consulte a Figura 1.
- Após a adição de Jurkat a cada poço contendo as células Raji aderidas na etapa 5.3, localize rapidamente a lâmina da câmara de micropoços na incubadora de estágio de microscópio pré-aquecida (1-2 h) (ou seja, OKOlab) e selecione algumas posições XY com o microscópio, campos nos quais é provável que registre uma formação emergente de IS feita por, por exemplo, uma célula transfectada por Jurkat caindo no foco do microscópio.
- Use uma incubadora de platina de microscópio pré-aquecida, pois foi observado que uma platina estabilizada por temperatura mantém as posições X, Y, Z estáveis. Os critérios para um campo XY conveniente são: células Raji bem focadas e não confluentes (ou seja, exibindo lacunas entre as células) e a presença de células Jurkat transfectadas (isso pode ser verificado combinando transmitância e canais UV ou GFP). As células de Jurkat sedimentarão muito rapidamente (alguns minutos) na lâmina da câmara, e as chances de obter imagens de sinapses emergentes diminuirão com o tempo (Figura 1). É possível terminar o experimento após o lapso de tempo definido ou prosseguir para a Etapa 7 e fixar os conjugados para imunofluorescência e análises subsequentes.
NOTA: É possível selecionar até 16 campos de microscópio diferentes de até 4 micropoços diferentes para aquisição simultânea de lapso de tempo de vários poços com a resolução temporal adequada (1-2 min por quadro). A limitação depende do número e da intensidade (afetando a exposição da câmera) dos diversos fluorocromos a serem fotografados (dependendo do número de proteínas fluorescentes expressas, além do CMAC). Uma maneira de aumentar a taxa de quadros é gravar para o canal CMAC em apenas um de cada "n" períodos de tempo para GFP (ou seja, n = 8, conforme mostrado na Figura 2), uma vez que as células Raji estão aderidas ao fundo do poço e não se movem facilmente como células Jurkat. Além disso, isso beneficia a viabilidade celular, uma vez que a exposição frequente à luz ultravioleta pode danificar as células. Tente ajustar a taxa de quadros de tempo para 1 quadro a cada 1 minuto ou menos (ou seja, 20 s por quadro, Figura 2), pois a polarização do MVB leva de alguns minutos a horas para ser concluída. Um microscópio equipado com uma torre de epifluorescência motorizada e filtros de fluorescência passa-banda apropriados ou equivalentes é necessário para realizar essa captura multicanal.
