Reconhecimento de marcadores CD de células assassinas induzidas por citocinas humanas por citometria de fluxo

Resumo

Fonte: Hsiao, C. H., et al. Isolamento e expansão de citocitocito. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos uma técnica baseada em citometria de fluxo para determinar a proporção de células T assassinas induzidas por citocinas, células CIK, expandidas a partir de uma cultura de células mononucleares de sangue periférico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Indução e expansão CIK

1. No dia 0, cultive os PBMCs (1 x 10⁶) em meio basal fresco contendo 1.000 UI / mL de IFN-γ por 24 h em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. No Dia 1, atualize o meio com meio basal fresco contendo 50 ng/mL de anticorpo anti-CD3, 1 ng/mL de rh IL-1α e 1.000 U/mL de rh IL-2. Atualize o meio a cada 3 dias.
3. No dia 7, atualize o meio com meio basal fresco contendo 1.000 U / mL de IL-2 rh. Atualize o meio a cada 3 dias até o final da expansão celular (Dia 14).

2. Imunofenotipagem para avaliação de células CIK

1. Lave as células CIK com 10 mL de PBS estéril. Centrifugue por 10 min a 300 x g e 18−20 ° C, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células com 10 mL de PBS. Conte o número de células e teste a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de azul de tripano.
2. Alicote as células CIK em seis tubos estéreis de 1,5 mL a uma densidade de ~ 5–10 x 10⁵ células/mL PBS. Rotular e tratar da seguinte forma: Tubo 1, Branco (sem anticorpos); Tubo 2, adicionar 20 μL do isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, adicionar 20 μL de mAbs do isotipo IgG1-APC; Tubo 4, adicionar 20 μL de CD3-FITC; Tubo 5, adicione 20 μL de CD56-APC mAbs; e Tubo 6, adicionar 20 μL de CD3-FITC e 20 μL de CD56-APC mAbs.
3. Misture suavemente as células CIK com os anticorpos, pipetando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL e, em seguida, incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
4. Centrifugue os tubos por 10 min a 300 x g e 18−20 ° C. Aspire o sobrenadante e suspenda o pellet celular uma vez com 1 mL de PBS. Pipete-os suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL.
5. Repita a etapa 2.4.
6. Deixe os tubos no escuro antes da análise por citometria de fluxo.

3. Reconhecimento de marcador de CD

1. Transfira a suspensão celular para um tubo inferior redondo de poliestireno estéril de 5 mL com uma tampa de filtro de célula (malha de 100 μm) pipetando suavemente através da tampa. Coloque os tubos no carrossel em ordem.
2. Abra o software de análise de citometria de fluxo e crie uma pasta experimental. Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime e um tubo ao experimento e nomeie os tubos da seguinte forma: Tubo 1, Em branco; Tubo 2, isotipo IgG1-CD3; Tubo 3, isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Crie um sistema de bloqueio de dispersão para as populações de células CIK (Figura 1A).
   1. Selecione Tubo 1 (em branco) e clique no botão Dot Plot para criar um gráfico FSC-A/SSC-A. Desenhe uma porta retangular sobre toda a população de células com um limite FSC-A >5 x 10⁴ para excluir detritos celulares.
   2. Selecione o parâmetro SSC-A/SSC-H para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de polígono ao redor de todas as células individuais. Selecione os parâmetros Contagem/FITC (CD3) e Contagem/APC (CD56) para o novo gráfico de histograma, respectivamente. Selecione o parâmetro FITC (CD3)/APC (CD56) para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
   3. Registre os dados de 20.000 células individuais em cada amostra. Clique no botão Carregar Exemplo para analisar primeiro o exemplo de controle em branco. Identifique toda a população de células CIK usando os parâmetros dos canais CD56 e CD3.
4. Repita a etapa 3.3 para a investigação de todas as amostras.
5. Abra os arquivos que contêm os valores estatísticos da amostra individual para analisar as populações de células CIK e reimprima-os em arquivos de análise.

Resultados

Figura 1: A proporção de células T CD3 ⁺ CD56 ⁺ de uma amostra representativa de PBMC.(A) Os linfócitos foram reconhecidos por tamanho e granularidade específicos. População de células únicas selecionada para análise por citometria de fluxo. (B) A análise estatística da eficácia da expansão CIK de três doadores saudáveis foi realizada usando um teste t (*, p < 0,01).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-CD56 humano de camundongo APC	Bd	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Citômetro de Fluxo	Bd	338962	SN: R33896202856
Eagle Modificado Meio / F12 de Dulbecco	HyClone	SH30023.02	Meio basal para cultura de células OC-3
Soro fetal bovino	HyClone	SH30084.03	Para cultura de células K562 e OC-3. O meio completo contém 10% de FBS
Ficoll-Paque Plus	Ciências da Vida da GE Healthcare	71101700-EK	Solução de gradiente de densidade
Anticorpo CD3 anti-humano de camundongo FITC	Bd	555332	UCHT1
Mouse FITC IgG1, controle de isotipo κ	Bd	555748	MOPC-21
mAb anti-CD3 humano	Takara	T210	OKT3 Adicione 2,5 mL de estoque (1 mg / 1 mL) a 50 mL de meio de indução. Estoque de armazenamento a -80 °C
RPMI1640 médio	Gibco	11875-085	Meio basal para cultura de células K562. Estoque de armazenamento a 4 °C