Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Transferência Adotiva de Células T CD8+ Específicas para Antigênicos em Camundongos
- Isole as células T CD8+ específicas para ovalbumina (OVA) que expressam proteína fluorescente verde (OTI-GFP) ou proteína fluorescente vermelha (OTI-RFP) da suspensão de linfonodos de camundongos transgênicos com receptores de células T usando um kit de isolamento de células T CD8+ de camundongo de acordo com as instruções de fabricação. Prepare a suspensão celular esmagando os gânglios linfáticos usando um êmbolo de seringa, conforme descrito anteriormente.
- Transfira células OTI-GFP ou OTI-RFP (3 x 10,6 células) para receptores de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem por injeção intravenosa, conforme descrito por Cahalan, et al. Use camundongos com idade tipicamente de 6 a 12 semanas.
nota: Esta etapa é opcional e necessária apenas para rastrear células T CD8+ específicas do antígeno.
2. Infecção por Listeria monocytogenes
- Expandir L. monocytogenes geneticamente modificado para expressar OVA (LM-OVA) para uma fase exponencial de crescimento em infusão de coração em caldo a 37 ° C sob agitação suave até que o OD600 atinja 0,08-0,1, conforme descrito anteriormente.
- Injete 100 μL (volume máximo = 200 μL) de 0,1–0,5 LD50 LM-OVA diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por injeção intravenosa usando uma seringa de insulina 29 G, em receptores de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem portadores de células OTI-GFP ou OTI-RFP quando indicado.
nota: Em nossas mãos, 0,1 x LD50 LM-OVA corresponde a 2 x 104 unidades formadoras de colônias (UFC). L. monocytogenes geneticamente modificada para expressar OVA é usada para ativar as células T CD8+ OTI previamente transferidas, mas outras cepas de L. monocytogenes podem ser usadas.
3. Tratamento com Brefeldina A (BFA) para Bloquear a Secreção de Citocinas
- Injete 250 μg de BFA em 200 μL de PBS por via intraperitoneal por 6 h antes do sacrifício do camundongo usando uma seringa de insulina 29 G.
nota: O BFA liofilizado é primeiro ressuspenso em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar um estoque de concentração de 25 mg/mL. O BFA é então diluído em PBS à temperatura ambiente (RT) para evitar a cristalização antes da injeção. A inibição da secreção de citocinas induz o acúmulo de IFNγ nas células. Isso é crucial para a detecção de citocinas.
4. Colhendo o baço
- Eutanasiar os camundongos usando concentrações crescentes de CO2 seguidas de luxação cervical.
nota: Siga as diretrizes da instituição local para a eutanásia humana de camundongos.
- Limpe o abdômen com etanol a 70% e faça uma incisão com uma tesoura para fazer um corte de 1–2 cm na pele do flanco esquerdo do camundongo, onde o baço está localizado. Faça cuidadosamente uma incisão no peritônio para expor o baço e retire-o com uma pinça. Colha o baço, tomando cuidado para não apertá-lo com uma pinça ou cortá-lo para evitar interromper a arquitetura do baço.
5. Fixação do Baço com Paraformaldeído (PFA)
- Prepare a solução fixadora misturando 3,75 mL de PBS e 3,75 mL de L-lisina 0,2 M. Adicione 21 mg de m-periodato de sódio e misture bem. Em seguida, adicione 2,5 mL de PFA a 4% e 20 μL de NaOH 12 N.
nota: Use a solução fixadora no mesmo dia e descarte o excesso. Não o guarde. Esta etapa de fixação é importante se a amostra contiver proteínas fluorescentes, como GFP. Não use PFA contendo vestígios de metanol, pois ele desnatura proteínas fluorescentes.
cuidado: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cautela.
- Mergulhe o baço no fixador e fixe por um mínimo de 4 h, normalmente 16–20 h a 4 ° C sob agitação suave.
- Descarte a solução fixadora e adicione 5 mL de PBS por 5 min em RT sob agitação suave.
- Substitua o PBS por 5 ml de PBS fresco e incube durante 1 h a 4 °C sob agitação suave.
- Substitua o PBS por 5 mL de sacarose a 30% e incube por 12 a 24 h.
nota: Este método ajuda a manter a morfologia do tecido. Após a incubação com solução de sacarose, o órgão deve afundar no fundo do poço.
6. Congelamento e seccionamento
- Coloque gelo seco em um recipiente grande e coloque um recipiente menor dentro contendo cerca de 50 mL de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco.
- Seque suavemente o baço com um pano sem fiapos.
- Coloque o baço dentro de um molde de base contendo uma gota de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior. Tenha cuidado para não produzir bolhas. Adicione OCT sobre o baço.
- Com uma pinça, deposite o molde base na superfície do metanol, certificando-se de que ele não toque na OCT. Congelar o tecido o mais rápido possível para minimizar os artefatos.
- Quando estiver congelado, prossiga com o seccionamento.
nota: O baço congelado pode ser mantido a -80 °C por vários meses.
- Corte o tecido usando um criomicrótomo.
- Ajuste a temperatura da câmara no criostato para -21 °C. Corte seções da espessura desejada (geralmente em torno de 10 μm). Este protocolo funciona com espessuras de até 30 μm.
- Colete seções em lâminas de microscópio de vidro (consulte a Tabela de Materiais) e inspecione visualmente.
nota: As seções podem ser mantidas a -80 °C por vários meses.
7. Coloração Imunofluorescente
- Permita que a seção chegue ao RT.
- Desenhe um círculo com um bloqueador de líquido (por exemplo, caneta PAP) ao redor da seção de tecido. Desenhe fora da OCT ou ela não grudará.
- Depois de seco, reidratar a amostra colocando PBS na seção de tecido por 5 min.
nota: O volume colocado na seção depende do tamanho da seção. Normalmente usamos 100–300 μL. Não deixe as seções secarem depois de reidratadas.
- Enxágue com PBS pelo menos duas vezes para garantir que a seção esteja bem aderida à lâmina.
- Adicione uma solução de bloqueio à seção para diminuir a ligação não específica de anticorpos.
- Prepare a solução de bloqueio da seguinte forma: PBS com 0,1% de Triton X100, 2% de soro fetal de bezerro (FCS), 2,5 μg / mL de bloqueador do receptor Fc (anti-camundongo CD16 / 32). Em seguida, adicione 2–5% de soro normal das espécies de cada anticorpo secundário do painel de coloração.
nota: Se os anticorpos forem diretamente conjugados/biotinilados, adicione 5% de soro normal da espécie de cada anticorpo primário. Se um anticorpo primário e um dos anticorpos secundários forem da mesma espécie (por exemplo, anticorpo primário criado em coelho e anti-rato secundário de coelho), não use a espécie de soro normal, pois isso aumentará o sinal de fundo.
- Remova suavemente o PBS da seção por aspiração e adicione 100 μL da solução de bloqueio por seção de amostra. Incubar numa câmara húmida coberta durante um mínimo de 1 h em RT.
- Corar com anticorpos primários.
- Diluir os anticorpos primários na concentração ideal na solução de bloqueio. A concentração geral de anticorpos no ponto de partida é de 5 μg/mL, mas deve ser otimizada para cada anticorpo e tecido.
nota: Se os anticorpos forem conjugados directamente, centrifugue a mistura de anticorpos a 17,135 x g (13,500 rpm) durante 15 minutos a 4 °C antes de a utilizar. Os fluoróforos podem precipitar. Esta etapa irá granular os precipitados e, assim, evitar a deposição não específica dos anticorpos precipitados na lâmina.
- Substitua a solução de bloqueio pela mistura primária de anticorpos para cada amostra.
- Incubar durante 4 h em RT ou durante a noite (OVN) a 4 °C numa câmara húmida coberta.
- Realize a lavagem.
- Prepare o tampão de lavagem adicionando 2% de FCS ao PBS.
- Lave 4 vezes com tampão de lavagem: uma rápida (sem incubação), uma por 10 min e duas por 5 min. Em seguida, faça uma lavagem final com PBS por 5 min.
- Coloração com anticorpos secundários.
- Diluir os anticorpos secundários de interesse na concentração ideal na solução de bloqueio. Centrifugar a mistura, conforme descrito para os anticorpos primários.
- Remova a solução de lavagem final. Adicione a mistura de anticorpos secundários no topo da seção e incube por 1–4 h em RT em uma câmara úmida coberta.
- Lave 4 vezes com tampão de lavagem: uma rápida (sem incubação), uma por 10 min e duas por 5 min. Em seguida, faça uma lavagem final com PBS por 5 min.
- Remova a solução de lavagem final. Deixe o PBS evaporar, mas não seque demais a seção. Coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra e coloque cuidadosamente a lamínula em cima dela. O suporte de montagem deve recuperar toda a seção. Deixe-o polimerase OVN em RT protegido da luz.
nota: Desenhe um círculo ao redor da seção no verso do slide antes de aplicar o meio de montagem. Uma vez que o meio de montagem é aplicado, o tecido pode se tornar difícil de ver.
- Armazene os slides no escuro a 4 °C até que estejam prontos para a imagem.
8. Imagem e Análise
- Realize a imagem da coloração com um microscópio confocal.
nota: Neste protocolo, foi utilizado um microscópio de varredura a laser espectral invertido (ver Tabela de Materiais), juntamente com as objetivas 10x/NA 0,40 ou 60x/NA 1,4 (para análise da localização subcelular de citocinas). Os comprimentos de onda de excitação e emissão são exibidos para cada fluoróforo e proteína fluorescente na Tabela de Materiais.
- Realize análises e quantificação conforme necessário usando software de processamento de imagem (por exemplo, Imaris ou Fiji).
