Ensaio para a identificação da secreção de interferon-gama em órgãos linfóides murinos

Resumo

Fonte: Mazet, J. M., et al. Imagem da produção de gamaferon in situ no baço de camundongo após infecção por Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método de imagem para visualizar a secreção in situ de interferon-gama (IFN-γ) no baço de camundongo. Após a infecção bacteriana e a indução do acúmulo de IFN-γ dentro das células T e células assassinas naturais, o baço é colhido do camundongo. Após a obtenção de cortes de tecido, a imunocoloração é realizada para visualizar o IFN-γ dentro das células.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Transferência Adotiva de Células T CD8+ Específicas para Antigênicos em Camundongos

1. Isole as células T CD8⁺ específicas para ovalbumina (OVA) que expressam proteína fluorescente verde (OTI-GFP) ou proteína fluorescente vermelha (OTI-RFP) da suspensão de linfonodos de camundongos transgênicos com receptores de células T usando um kit de isolamento de células T CD8⁺ de camundongo de acordo com as instruções de fabricação. Prepare a suspensão celular esmagando os gânglios linfáticos usando um êmbolo de seringa, conforme descrito anteriormente.
2. Transfira células OTI-GFP ou OTI-RFP (3 x 10,⁶ células) para receptores de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem por injeção intravenosa, conforme descrito por Cahalan, et al. Use camundongos com idade tipicamente de 6 a 12 semanas.
   nota: Esta etapa é opcional e necessária apenas para rastrear células T CD8⁺ específicas do antígeno.

2. Infecção por Listeria monocytogenes

1. Expandir L. monocytogenes geneticamente modificado para expressar OVA (LM-OVA) para uma fase exponencial de crescimento em infusão de coração em caldo a 37 ° C sob agitação suave até que o OD600 atinja 0,08-0,1, conforme descrito anteriormente.
2. Injete 100 μL (volume máximo = 200 μL) de 0,1–0,5 LD50 LM-OVA diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por injeção intravenosa usando uma seringa de insulina 29 G, em receptores de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem portadores de células OTI-GFP ou OTI-RFP quando indicado.
   nota: Em nossas mãos, 0,1 x LD50 LM-OVA corresponde a 2 x 10⁴ unidades formadoras de colônias (UFC). L. monocytogenes geneticamente modificada para expressar OVA é usada para ativar as células T CD8⁺ OTI previamente transferidas, mas outras cepas de L. monocytogenes podem ser usadas.

3. Tratamento com Brefeldina A (BFA) para Bloquear a Secreção de Citocinas

1. Injete 250 μg de BFA em 200 μL de PBS por via intraperitoneal por 6 h antes do sacrifício do camundongo usando uma seringa de insulina 29 G.
   nota: O BFA liofilizado é primeiro ressuspenso em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar um estoque de concentração de 25 mg/mL. O BFA é então diluído em PBS à temperatura ambiente (RT) para evitar a cristalização antes da injeção. A inibição da secreção de citocinas induz o acúmulo de IFNγ nas células. Isso é crucial para a detecção de citocinas.

4. Colhendo o baço

1. Eutanasiar os camundongos usando concentrações crescentes de CO₂ seguidas de luxação cervical.
   nota: Siga as diretrizes da instituição local para a eutanásia humana de camundongos.
2. Limpe o abdômen com etanol a 70% e faça uma incisão com uma tesoura para fazer um corte de 1–2 cm na pele do flanco esquerdo do camundongo, onde o baço está localizado. Faça cuidadosamente uma incisão no peritônio para expor o baço e retire-o com uma pinça. Colha o baço, tomando cuidado para não apertá-lo com uma pinça ou cortá-lo para evitar interromper a arquitetura do baço.

5. Fixação do Baço com Paraformaldeído (PFA)

1. Prepare a solução fixadora misturando 3,75 mL de PBS e 3,75 mL de L-lisina 0,2 M. Adicione 21 mg de m-periodato de sódio e misture bem. Em seguida, adicione 2,5 mL de PFA a 4% e 20 μL de NaOH 12 N.
   nota: Use a solução fixadora no mesmo dia e descarte o excesso. Não o guarde. Esta etapa de fixação é importante se a amostra contiver proteínas fluorescentes, como GFP. Não use PFA contendo vestígios de metanol, pois ele desnatura proteínas fluorescentes.
   cuidado: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cautela.
2. Mergulhe o baço no fixador e fixe por um mínimo de 4 h, normalmente 16–20 h a 4 ° C sob agitação suave.
3. Descarte a solução fixadora e adicione 5 mL de PBS por 5 min em RT sob agitação suave.
4. Substitua o PBS por 5 ml de PBS fresco e incube durante 1 h a 4 °C sob agitação suave.
5. Substitua o PBS por 5 mL de sacarose a 30% e incube por 12 a 24 h.
   nota: Este método ajuda a manter a morfologia do tecido. Após a incubação com solução de sacarose, o órgão deve afundar no fundo do poço.

6. Congelamento e seccionamento

1. Coloque gelo seco em um recipiente grande e coloque um recipiente menor dentro contendo cerca de 50 mL de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco.
2. Seque suavemente o baço com um pano sem fiapos.
3. Coloque o baço dentro de um molde de base contendo uma gota de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior. Tenha cuidado para não produzir bolhas. Adicione OCT sobre o baço.
4. Com uma pinça, deposite o molde base na superfície do metanol, certificando-se de que ele não toque na OCT. Congelar o tecido o mais rápido possível para minimizar os artefatos.
5. Quando estiver congelado, prossiga com o seccionamento.
   nota: O baço congelado pode ser mantido a -80 °C por vários meses.
6. Corte o tecido usando um criomicrótomo.
   1. Ajuste a temperatura da câmara no criostato para -21 °C. Corte seções da espessura desejada (geralmente em torno de 10 μm). Este protocolo funciona com espessuras de até 30 μm.
7. Colete seções em lâminas de microscópio de vidro (consulte a Tabela de Materiais) e inspecione visualmente.
   nota: As seções podem ser mantidas a -80 °C por vários meses.

7. Coloração Imunofluorescente

1. Permita que a seção chegue ao RT.
2. Desenhe um círculo com um bloqueador de líquido (por exemplo, caneta PAP) ao redor da seção de tecido. Desenhe fora da OCT ou ela não grudará.
3. Depois de seco, reidratar a amostra colocando PBS na seção de tecido por 5 min.
   nota: O volume colocado na seção depende do tamanho da seção. Normalmente usamos 100–300 μL. Não deixe as seções secarem depois de reidratadas.
4. Enxágue com PBS pelo menos duas vezes para garantir que a seção esteja bem aderida à lâmina.
5. Adicione uma solução de bloqueio à seção para diminuir a ligação não específica de anticorpos.
   1. Prepare a solução de bloqueio da seguinte forma: PBS com 0,1% de Triton X100, 2% de soro fetal de bezerro (FCS), 2,5 μg / mL de bloqueador do receptor Fc (anti-camundongo CD16 / 32). Em seguida, adicione 2–5% de soro normal das espécies de cada anticorpo secundário do painel de coloração.
      nota: Se os anticorpos forem diretamente conjugados/biotinilados, adicione 5% de soro normal da espécie de cada anticorpo primário. Se um anticorpo primário e um dos anticorpos secundários forem da mesma espécie (por exemplo, anticorpo primário criado em coelho e anti-rato secundário de coelho), não use a espécie de soro normal, pois isso aumentará o sinal de fundo.
   2. Remova suavemente o PBS da seção por aspiração e adicione 100 μL da solução de bloqueio por seção de amostra. Incubar numa câmara húmida coberta durante um mínimo de 1 h em RT.
6. Corar com anticorpos primários.
   1. Diluir os anticorpos primários na concentração ideal na solução de bloqueio. A concentração geral de anticorpos no ponto de partida é de 5 μg/mL, mas deve ser otimizada para cada anticorpo e tecido.
      nota: Se os anticorpos forem conjugados directamente, centrifugue a mistura de anticorpos a 17,135 x g (13,500 rpm) durante 15 minutos a 4 °C antes de a utilizar. Os fluoróforos podem precipitar. Esta etapa irá granular os precipitados e, assim, evitar a deposição não específica dos anticorpos precipitados na lâmina.
   2. Substitua a solução de bloqueio pela mistura primária de anticorpos para cada amostra.
   3. Incubar durante 4 h em RT ou durante a noite (OVN) a 4 °C numa câmara húmida coberta.
7. Realize a lavagem.
   1. Prepare o tampão de lavagem adicionando 2% de FCS ao PBS.
   2. Lave 4 vezes com tampão de lavagem: uma rápida (sem incubação), uma por 10 min e duas por 5 min. Em seguida, faça uma lavagem final com PBS por 5 min.
8. Coloração com anticorpos secundários.
   1. Diluir os anticorpos secundários de interesse na concentração ideal na solução de bloqueio. Centrifugar a mistura, conforme descrito para os anticorpos primários.
   2. Remova a solução de lavagem final. Adicione a mistura de anticorpos secundários no topo da seção e incube por 1–4 h em RT em uma câmara úmida coberta.
9. Lave 4 vezes com tampão de lavagem: uma rápida (sem incubação), uma por 10 min e duas por 5 min. Em seguida, faça uma lavagem final com PBS por 5 min.
10. Remova a solução de lavagem final. Deixe o PBS evaporar, mas não seque demais a seção. Coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra e coloque cuidadosamente a lamínula em cima dela. O suporte de montagem deve recuperar toda a seção. Deixe-o polimerase OVN em RT protegido da luz.
    nota: Desenhe um círculo ao redor da seção no verso do slide antes de aplicar o meio de montagem. Uma vez que o meio de montagem é aplicado, o tecido pode se tornar difícil de ver.
11. Armazene os slides no escuro a 4 °C até que estejam prontos para a imagem.

8. Imagem e Análise

1. Realize a imagem da coloração com um microscópio confocal.
   nota: Neste protocolo, foi utilizado um microscópio de varredura a laser espectral invertido (ver Tabela de Materiais), juntamente com as objetivas 10x/NA 0,40 ou 60x/NA 1,4 (para análise da localização subcelular de citocinas). Os comprimentos de onda de excitação e emissão são exibidos para cada fluoróforo e proteína fluorescente na Tabela de Materiais.
2. Realize análises e quantificação conforme necessário usando software de processamento de imagem (por exemplo, Imaris ou Fiji).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Brefeldin A	Biociência de Cambridge	CAY11861
Paraformaldeído	Ágar científico	R1018
Cloridrato de L-lisina	Ciência da vida Sigma	L5751
Meta-periodato de sódio	Thermo Científico	20504
D(+)-sacarose	Produtos químicos da VWR	Rolamento 27480.294
Lenços de precisão de papel Kimtech science	Profissional da Kimberly-Clark	Rolamento 75512
Composto O.C.T., meio de montagem para criotomia	Produtos químicos da VWR	361603E
Bloco Fc, anti-rato purificado CD16/32, clone 93	Biolenda	101302	Clone de anticorpo e concentração usada: 2,5 mg/ml
Lâminas de microscópio - Superfrost Plus	Produtos químicos da VWR	Nº 631-0108
anti-CD169 - AF647	Biolenda	142407	Clone de anticorpos e concentração utilizados: clone 3D6.112 1,6 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 650
			Comprimento de onda de emissão: 65
anti-F4/80 - APC	Biolenda	123115	Clone de anticorpo e concentração utilizados: clone BM8 2,5 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 650
			Comprimento de onda de emissão: 660
anti-B220 - PB	Biolenda	Rolamento 103230	Clone de anticorpo e concentração utilizados: clone RA3-6B2 1,6 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 410
			Comprimento de onda de emissão: 455
anti-IFNg - biotina	Biolenda	505804	Clone de anticorpos e concentração usados: clone XMG1.2 5 mg/ml
anti-IFNg - BV421	Biolenda	505829	Clone de anticorpos e concentração usados: clone XMG1.2 5 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 405
			Comprimento de onda de emissão: 436
anti-Nkp46/NCRI	Sistemas de P&D	AF2225	Clone de anticorpo e concentração utilizada: caprino 2,5 mg/ml
IgG-FITC anti-caprino	Novusbio	NPp 1-74814	Clone de anticorpos e concentração utilizada: 1 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 490
			Comprimento de onda de emissão: 525
Estreptavidina - PE	Biolenda	405203	Clone de anticorpo e concentração usada: 2,5 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 565
			Comprimento de onda de emissão: 578
estreptavidina - FITC	Biolenda	405201	Clone de anticorpo e concentração usada: 2,5 mg/ml
			Comprimento de onda de excitação: 490
			Comprimento de onda de emissão: 525
Fluoromount G	Biotecnologia do Sul	Nº 0100-01
Óculos de cobertura 22x40mm	Menzel-Glazer	12352128
Bloqueador de líquidos super PAP PEN mini	Axxora	CAC-DAI-PAP-S-M
Imaris - Software de Análise de Imagens de Microscopia	Plano de bits
Microscópio confocal - Olympus FV1200 Microscópio de varredura a laser	Olimpo
Criostato - CM 1900 UV	Leica
Molde de base descartável	Fisher Scientific Reino Unido Ltda	11670990
PBS 1X	Tecnologias de Vida Ltda	20012068
Caldo BHI	Marca VWR	303415ZA
GFP			Comprimento de onda de excitação: 484
			Comprimento de onda de emissão: 507
Rfp			Comprimento de onda de excitação: 558
			Comprimento de onda de emissão: 583
Seringa de insulina, com agulha, 29G	VWR Internacional	BDAM324824
C57BL/6 camundongos do tipo selvagem	Rio Charles