Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Purificação de plaquetas
NOTA: A purificação das plaquetas deve ser realizada à temperatura ambiente para evitar sua degradação. Certifique-se de que a temperatura dos reagentes e instrumentos esteja entre 18 e 22 °C. Para evitar a degradação plaquetária, pipetagem rápida e agitação vigorosa devem ser evitadas durante o procedimento.
- Adicione 600 μL de meio gradiente de iohexol (pó de iohexol a 12% em cloreto de sódio a 0,85%, tricina 5 mM, pH 7,2) em um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 200 μL de amostra de sangue lentamente pela lateral do tubo em cima do meio gradiente com uma ponta de pipeta de furo largo para que o sangue e o meio iohexol não se misturem (Figura 1A).
- Centrifugar a amostra contendo o tubo a 400 x g durante 20 min a 20 °C num rotor de balde oscilante com aceleração e desaceleração lentas.
- Colete a maior parte da camada rica em plaquetas e uma pequena fração da camada pobre em plaquetas (total de 300 a 400 μL) usando uma ponta de pipeta de diâmetro largo sem perturbar as camadas de hemácias e leucócitos (Figura 1B). Transfira a amostra de plaquetas para um novo tubo.
nota: Se a contagem de plaquetas for menor no sangue ou um volume menor de sangue for usado, a camada rica em plaquetas e a camada pobre em plaquetas podem ser vistas como uma única camada.
- Adicione 1 mL de PBS à amostra de plaquetas, misture invertendo e centrifugue a 800 x g por 10 min a 20 ° C em um rotor de balde oscilante. Descarte a solução completamente e adicione 200 μL de PBS para ressuspender as plaquetas com pipetagem leve.
nota: Esta etapa é opcional, pois remove o meio gradiente e as proteínas plasmáticas e aumenta a sensibilidade das plaquetas a agonistas como a trombina. Como centrífugas diferentes têm programas diferentes, a aceleração/desaceleração lenta pode ser determinada lendo o manual do usuário da centrífuga.
- Transfira 30 μL desta amostra para um novo tubo para contar as plaquetas. As plaquetas restantes podem ser usadas para ensaios bioquímicos e fisiológicos, como ativação plaquetária, agregação, liberação de grânulos, etc.
- Para extração de RNA ou proteína, centrifugue a amostra de plaquetas a 800 x g por 10 min para granular as plaquetas. Rejeitar completamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Adicione o volume desejado de RNA ou tampão de lise de proteína para lisar as plaquetas.
2. Ativação plaquetária
- Em um tubo, adicione 1 a 2 milhões de plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração (PBS com 2% de soro fetal bovino, FBS).
- Para um número múltiplo de amostras, faça uma mistura principal de anticorpos com 1 μL (0,5 mg / mL) do seguinte: PE-Cy7 rato anti-camundongo TER 119, PE rato anti-camundongo CD45, FITC rato anti-camundongo CD41 e APC rato anti-camundongo / humano CD62P (P-selectina) para detectar hemácias, leucócitos, plaquetas e plaquetas ativadas, respectivamente. Adicione a mistura principal aos tubos para colorir as células. Não adicione trombina.
- Em outro tubo, adicione 1 a 2 milhões de plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração e peptídeo GPRP 0,4 mM. Adicione trombina para ativar as plaquetas e corar as células seguindo o passo 2.2.
nota: O GPRP deve ser adicionado à amostra antes de adicionar trombina para evitar a formação de agregados ou coágulos por meio da ativação plaquetária. A concentração de trombina deve ser otimizada para obter uma boa ativação das plaquetas. Após a ativação plaquetária, a contagem de eventos diminui durante a aquisição de amostras por citometria de fluxo.
- Como controle positivo, adicione 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração em um tubo e peptídeo GPRP de 0,4 mM. Adicione trombina para ativar as plaquetas. Como controle negativo, adicione 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração. Não adicionar trombina à amostra de controlo negativo. Manchar as células seguindo o passo 2.2.
- Para controle de isotipo de citometria de fluxo, rotule 5 tubos com não corados, PE-Cy7, PE, FITC e APC. Adicione 100 μL de tampão de coloração, 1 μL de sangue e 1 μL do respectivo anticorpo aos tubos marcados para corar as células.
- Incube as amostras para corar por 30 min em temperatura ambiente no escuro.
- Lave as amostras adicionando 1 mL de tampão de coloração a cada tubo. Centrifugue a 800 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o tampão de coloração com cuidado, sem desalojar o pellet.
- Adicione 300 μL de tampão de coloração a cada tubo, misture suavemente e transfira para um tubo FACS. Armazene as amostras coradas no escuro até serem analisadas com um citômetro de fluxo.
