Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de meios, soluções enzimáticas e animais
- Prepare álcool iodado a 1% dissolvendo 1 g de iodo em 100 ml de etanol.
- Prepare 2x 500 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS) sem Ca2+ e Mg2+ suplementados cada um com 7,5 ml de D-glicose (100 g / L) e 5 ml de solução estoque de penicilina / estreptomicina 100x (15 mg / ml de D-glicose, 50 U / ml de penicilina e 50 μg / ml de estreptomicina final).
- Suplemento 1x 500 ml de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 5 ml de solução estoque de penicilina/estreptomicina 100x (50 U/ml de penicilina e 50 μg/ml de estreptomicina final).
- Prepare uma solução de tripsina-DNase I (2,5 mg/ml de tripsina e 10 μg/ml de DNase I) adicionando 25 mg de tripsina e 0,1 ml de DNase I (1 mg/ml de DNase I) a 9,9 ml de PBS.
- Dissolva 50 mg de inibidor de tripsina em 5 ml de PBS para solução de inibidor de tripsina A (10 mg / ml). Dissolva 25 mg de inibidor de tripsina em 10 ml de PBS para solução de inibidor de tripsina B (2,5 mg / ml).
- Para uma solução de colagenase-hialuronidase-desoxirribonuclease I (DNase I), dissolva 10 mg de colagenase A (1 mg / ml final), 10 mg de hialuronidase (1 mg / ml final) e 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) (10 μg / ml final) em 10 ml de PBS.
- Prepare uma solução de hialuronidase-DNase I adicionando 10 mg de hialuronidase (1 mg / ml final) e 0,1 ml de solução de DNase I (1 mg / ml) (10 μg / ml final) a 9,9 ml de PBS.
- Encomende ratos Wistar na hora certa para que tenham 19 dias de idade no dia do isolamento das células de Sertoli.
nota: O protocolo descrito é projetado para 10 ratos, mas pode ser modificado para um mínimo de 5 e um máximo de 20 ratos. Os volumes de todas as soluções devem ser ajustados de acordo.
No protocolo a seguir, uma "pipeta" significa uma pipeta sorológica.
2. Preparação de túbulos seminíferos
- Anestesiar 10 ratos Wistar machos, um a um, em um dessecador usando CO2 e uma taxa de fluxo que desloque pelo menos 20% do volume da câmara por minuto. Espere até que a respiração pare, teste a anestesia apertando uma almofada para as patas e, se não houver reação, eutanasiar cada rato por luxação cervical. Drene o sangue seccionando a veia jugular e a artéria carótida (vagina carótica) sob água corrente. Desinfete o abdômen limpando-o com etanol 70%.
- Usando uma pinça, levante a pele dos músculos abdominais e corte um lobo de pele oval que se estende da sínfise púbica ao esterno (Figura 1A) e bata-o para cima no peito. Em seguida, pegue os músculos abdominais e faça uma incisão medial da sínfise púbica ao esterno.
- Aperte o abdômen com os polegares da pelve para cima para empurrar os testículos para fora da pelve inferior. Escolha a almofada de gordura do epidídimo (Figura 1B) com uma pinça para puxar o testículo ainda mais. Corte o cordão espermático (Figura 1B), deixando a túnica albugínea intacta, e colete todos os testículos em 20 ml de PBS em um tubo cônico de 50 ml (Figura 1C).
- Após a coleta de todos os testículos, desinfete-os adicionando um volume igual (20 ml) de iodo a 1% (p / v) em etanol. Inverter o tubo duas vezes e decantar imediatamente o sobrenadante. Lave rapidamente os testículos duas vezes com 25 ml de PBS cada (Figura 1D).
- Transferir os testículos para uma placa de Petri contendo 15 ml de PBS (figura 1E). Segure cada testículo firmemente com uma pinça em uma extremidade, faça uma pequena incisão na túnica albugínea na extremidade oposta e esprema os túbulos usando lâminas de tesoura fechadas como ferramenta de raspagem.
nota: Os túbulos ainda devem formar um feixe compacto em forma de testículo com apenas alguns túbulos estendendo-se para dentro da solução, a fim de permitir uma digestão enzimática homogênea (Figura 1F).
- Transfira os testículos descapsulados para um frasco de 100 ml com tampa de rosca contendo 10 ml de solução de tripsina-DNase I. Efectuar a digestão em banho-maria agitado a 32 °C (120 oscilações/min). Após 4 min, avalie os túbulos a olho nu para dispersão dos túbulos. Assim que os túbulos começarem a se dispersar na solução, interrompa a digestão imediatamente. Se necessário, continue a incubação por até 2 min.
- Pare a digestão da tripsina adicionando 5 ml de solução inibidora de tripsina A. Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes usando uma pipeta de 10 ml e transfira-a para um tubo cônico de 50 ml.
- Após 5 minutos de incubação, observe os túbulos assentarem por unidade de gravidade, remova cuidadosamente o sobrenadante usando a pipeta de 10 ml da etapa 2.6 e adicione 10 ml de solução de inibidor de tripsina B para interromper completamente a digestão da tripsina. Ressuspenda os túbulos pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes.
- Para remover as células intersticiais contaminantes, lave os túbulos 9 vezes com 25 ml de PBS cada. Ressuspenda os túbulos em cada lavagem usando uma pipeta de 25 ml e deixe-os assentar por gravidade unitária por 10 min. Sempre use a mesma pipeta de 25 ml para pipetar PBS, ressuspensão e remoção do sobrenadante.
3. Remoção/Isolamento de Células Peritubulares (PTCs)
- Transferir todos os túbulos para um frasco de 100 ml com tampa de rosca e adicionar a solução de colagenase-hialuronidase-DNase I (Figura 2A). Efectuar a digestão durante 10 min em banho-maria agitado a 32 °C (120 oscilações/min).
- Pipete uma gota da suspensão em uma lâmina de vidro e verifique rapidamente os túbulos sob um microscópio de luz invertida para cultura de células de rotina com ampliação de 100x. Se a digestão não estiver avançada o suficiente, continue a incubação por mais 2 min (não conte o tempo necessário para a verificação microscópica).
nota: Durante esta etapa, todos os túbulos são encurtados em comprimento e as bordas dos túbulos devem se tornar ásperas (Figura 2B e C). Bordas ásperas são indicativas da liberação de células peritubulares.
- Transferir a suspensão com túbulos digeridos para um tubo cónico de 50 ml, utilizando a pipeta de 25 ml da etapa 2.8. Lave o frasco de 100 ml com 10 ml de PBS e adicione-o aos túbulos do tubo cônico. Deixar assentar os túbulos digeridos por unidade de gravidade durante 10 min, aspirar cuidadosamente o sobrenadante que contém os PTC, utilizando novamente a pipeta de 25 ml, e transferi-lo para um novo tubo cónico. Para a aspiração dos últimos mililitros, use uma pipeta de 5 ml para evitar qualquer transferência de túbulos.
4. Isolamento de Células de Sertoli (SCs)
- Ressuspenda completamente os túbulos sedimentados da etapa 3.3 em 25 ml de PBS usando uma pipeta de 25 ml e deixe-os assentar por gravidade unitária por 12 min. Use a mesma pipeta de 25 ml para pipetagem de PBS, ressuspensão de túbulos e remoção de sobrenadantes. Repita a lavagem 3 vezes (4 lavagens no total).
- Após a última lavagem, transferir os túbulos digeridos para outro frasco de 100 ml com tampa de rosca contendo a solução de Hialuronidase-DNase I. Efectuar a digestão em banho-maria agitado a 32 °C (120 oscilações/min).
- Após 5 minutos, verifique os túbulos novamente por inspeção microscópica leve com ampliação de 100X, conforme descrito na etapa 3.2.
nota: Túbulos curtos, agregados tubulares e células liberadas devem ser visíveis (Figura 2D).
- Deixar repousar os agregados tubulares durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante com uma pipeta de 25 ml. Lavar os agregados 4 vezes com 25 ml de PBS e um tempo de sedimentação de 10 min para cada etapa de lavagem (Figura 2E).
- Adicionar 20 ml de meio RPMI 1640 e passar a suspensão 10 vezes através de uma agulha de 18 G montada numa seringa de 20 ml. Evite bolhas de ar.
nota: Puxar a suspensão para dentro e para fora pela agulha é considerado como uma passagem. A ruptura e homogeneização de células por cisalhamento hidrodinâmico é uma técnica padrão na preparação de células que tendem a se agregar. É improvável que a passagem de células através de uma agulha hipodérmica de pequeno diâmetro interno tenha impacto em suas propriedades funcionais. As Figuras 3C e D mostram a ultraestrutura normal das células de Sertoli purificadas no dia 4 da cultura.
- Pipetar uma gota da suspensão em uma lâmina de vidro e verificar rapidamente os túbulos sob um microscópio de luz invertida para cultura de células de rotina com ampliação de 10X se os agregados estiverem todos dispersos (Figura 2F). Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para obter uma suspensão unicelular pura no filtrado.
- Centrifugar o filtrado do passo 4.4 a 200 x g durante 10 min à RT sem utilizar a quebra. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de 25 ml e ressuspender as células de Sertoli em meio RPMI 1640 de 40 ml (sem soro).
- Misture 100 μl de suspensão celular com 100 μl de Trypan Blue Stain e conte as células com uma câmara Neubauer Improved. Ajustar a concentração celular para 3 x 106 células/ml de acordo com o resultado da contagem. Semeie 1 ml por alvéolo numa placa de 6 poços (=dia 1). nota: As células de Sertoli em suspensão assentam rapidamente, de modo que o tubo deve ser agitado brevemente todas as vezes antes de uma alíquota celular ser retirada com a pipeta. Até o dia 4, eles se prendem firmemente ao substrato.
