Isolamento seletivo de células T CD4+ Vδ1+ γδ de células mononucleares do sangue periférico humano

Resumo

Fonte: Welker, C., et al. Isolamento e Ex Vivo Cultura de células T Vδ1⁺CD4⁺γδ, um progenitor de células αβT extratímicas. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra um protocolo para o isolamento baseado em marcação magnética de uma população de baixa concentração de células T CD4⁺Vδ1⁺γδ de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Usando uma combinação de anticorpos anti-Vδ1 conjugados com FITC, microesferas magnéticas anti-FITC e esferas superparamagnéticas revestidas com anticorpos anti-CD4, as células T CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ podem ser purificadas com sucesso da população PBMC.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Isolamento de células T Vδ1

1. Tome <1 x 10⁶ linfócitos isolados para um FACS inicial determinando a frequência de células T Vδ1 CD4.
   nota: O tamanho da população dessa entidade de células T pode diferir muito entre os indivíduos e de acordo com seu estado imunológico. Normalmente, cerca de 1% das células T são Vδ1⁺ e cerca de 1-5% das células Vδ1⁺ são CD4⁺.
   1. Diluir as células com 1 ml de tampão FACS, que consiste em PBS contendo 2% de FCS e 5 mM de EDTA. Centrifugar a 660 x g durante 2 min e transvasar o sobrenadante. O volume de refluxo de cerca de 100 μl de tampão FACS é suficiente para a coloração subsequente. Um breve vórtice e incube as células com 5 μl de reagente bloqueador de Fc por 5 min em RT para aumentar a especificidade da coloração FACS.
   2. Adicione anticorpos monoclonais humanos diretamente às células sem remover o reagente de bloqueio de Fc. Certifique-se de corar as células com anticorpos contra Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) e TCRαβ (1:25). Preparar o controlo isotípico com os isotipos de imunoglobulinas correspondentes. Incubar as células com anticorpos durante 20 min a 4 °C no escuro.
   3. Lavar as células em tampão FACS de 1 ml (centrifugar durante 2 min; a 660 x g), decantar o sobrenadante e proceder à aquisição do FACS no volume tampão restante.
2. Peletizar as células (que não são utilizadas na análise FACS) por centrifugação durante 12 min; a 300 g; 8 °C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 60 μl de tampão MACS por 1 x 10⁷ células. Adicione 20 μl de reagente bloqueador de Fc por 1 x 10⁷ células e incube por 5 min a 4 ° C.
3. Adicione 10 μl de anticorpo anti-Vδ1 humano conjugado com FITC por 1 x 10⁷ células diretamente às células. Incubar durante 12 min a 4 °C no escuro.
4. Lavar as células com 14 ml de tampão MACS (centrifugar durante 12 min; a 300 g; 8 °C). Rejeitar completamente o sobrenadante e ressuspender as células em 80 μl de tampão MACS por 1x10⁷ células.
5. Pegue 1-2 x 10⁵ células e dilua-as em tampão FACS de 100 μl para verificação da marcação por análise FACS. Não são necessários mais aditivos para esta etapa. Certifique-se de que haja uma diferença suficiente no brilho para células Vδ1^- e Vδ1⁺. Se não for esse o caso, repita as etapas 1.3 e 1.4.
6. Adicione 20 μl de microesferas anti-FITC por 1 x 10⁷ células às células restantes, misture bem e incube por 15 min no escuro a 4 ° C. Em seguida, lavar as células com pelo menos 10 ml de tampão MACS (centrifugar durante 12 min, a 300 x g; 8 °C).
7. Durante a centrifugação, equilibrar a coluna magnética pré-arrefecida colocada num íman com tampão MACS de 500 μl.
8. Ressuspenda as células em tampão MACS de 500 μl (para números de células superiores a 1 x 10⁸, aumente esse volume de acordo) e aplique as células cuidadosamente na coluna. Recolha o fluxo que contém as células Vδ1^-.
9. Lavar a coluna três vezes com tampão MACS de 500 μl e recolher novamente o fluxo no mesmo tubo. Observe que o reservatório deve estar vazio antes de aplicar o buffer na coluna.
10. Retirar a coluna do dispositivo magnético e colocá-la num tubo cónico de 15 ml. Lave rapidamente a coluna com 1 ml de tampão MACS, empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Colete o eluato em um tubo.
    NOTA: Para obter uma pureza de >98%, geralmente é necessário repetir as etapas 1.7-1.9 com uma segunda coluna.
11. Verificar a pureza das células por análise FACS com o mesmo painel de anticorpos de antes (ver 1.1.2) e contar as células.

2. Isolamento de células T Vδ1CD4⁺

1. Ressuspenda 25 μl de grânulos CD4 com um vórtice por >30 seg. Lave os grânulos (a quantidade mínima conforme prescrito pelo fabricante) em 1 ml de tampão MACS em um tubo de reação de 1,5 ml, colocando o tubo em um ímã por 1 min. Descarte o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta de pequena escala (200 μl) e ressuspenda os grânulos no volume original do tampão MACS.
2. Pelotizar as células Vδ1⁺ (centrifugar durante 12 min; a 300 x g) e aspirar o sobrenadante e ressuspender todas as células Vδ1⁺ em tampão MACS de 500 μl e adicioná-las ao tubo que contém os grânulos. Misture vigorosamente e incube por 20 min a 4 ° C com inclinação constante (por exemplo, em um rotador).
3. Coloque o tubo contendo as células em um ímã por 2 min. Certifique-se de que não haja restos na tampa.
   NOTA: As células CD4 ⁺ terão ligado as esferas magnéticas e se conectarão ao lado do tubo voltado para o ímã.
4. Abra cuidadosamente a tampa enquanto mantém o tubo dentro do dispositivo magnético e colete o sobrenadante que contém as células CD4-Vδ1⁺ usando uma pipeta de pequena escala. Coloque as células ^CD4-Vδ1+ em um tubo separado e coloque este tubo no ímã novamente para evitar que as células CD4 ou contas permaneçam da população.
   1. Lave as células CD4^- em tampão MACS de 5 ml (centrifugue por 12 min; a 300 x g) e ressuspenda-as em uma concentração de 1 x 10⁵ células por meio de 100 μl. As células CD4^- podem ser facilmente cultivadas em condições adequadas.
5. Coloque o tubo com os alvos das células CD4⁺ fora do campo magnético, ressuspenda as células em tampão MACS de 500 μl e coloque-as de volta no dispositivo magnético. Repita as etapas 2.3-2.5 duas vezes para obter uma pureza mais alta. Remova o sobrenadante por pipetagem.
6. Ressuspenda as células CD4⁺ em meio de cultura de 100 μl (RPMI 1640, 10% FCS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina) e adicione 10 μl de uma solução de descolamento de esferas. Incubar em RT por 45 min com inclinação constante (por exemplo, em um rotador).
7. Coloque as células em um ímã por 1 min. Colete cuidadosamente o sobrenadante contendo células Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ sem esferas usando uma pipeta de pequena escala.
8. Fora do ímã, ressuspenda os grânulos com 100 μl de meio de cultura e repita as etapas 2.6 e 2.7 duas vezes para obter um número maior de células CD4 ⁺.
9. Pelotizar as células (centrifugar a 300 x g, durante 12 min) e eliminar completamente o sobrenadante pipetando. Ressuspenda as células em meios frescos e pré-aquecidos e conte-as. Examinar a pureza das células Vδ1⁺CD4⁺ através da análise FACS descrita nos passos 1.1.1-1.1.3.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma Aldrich	D8537
Buffer MACS	Miltenyi Biotec	130-091-222	suplemente com BSA e pré-resfrie antes de usar
Bsa	Miltenyi Biotec	130-091-376	não obrigatoriamente deste fornecedor
anti-humano Vd1 FITC (clone: TS8.2)	Thermo Científico	TCR2730	não obrigatoriamente deste fornecedor
CD3 PerCP anti-humano (clone: SK7)	BD Biociências	345766	não obrigatoriamente deste fornecedor ou deste fluorocromo
anti-TCRab PE humano (clone: T10B9.1A-31)	BD Biociências	555548	não obrigatoriamente deste fornecedor ou deste fluorocromo
anti-humano CD4 VioBlue (clone: MT466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	não obrigatoriamente deste fornecedor ou deste fluorocromo
CD8 anti-humano APC-H7 (clone: SK1)	BD Biociências	Nº 641400	não obrigatoriamente deste fornecedor ou deste fluorocromo
Kit Anti-FITC MultiSort	Miltenyi Biotec	130-058-701	produz melhores resultados do que as MicroBeads anti-FITC
Colunas MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	Pré-resfriamento antes de usar
Separador MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
Kit de isolamento positivo CD4	Tecnologias de Vida	11331D