Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Geração de NETs
- Estimular neutrófilos com 500 nM de PMA (por 30 ml de solução de neutrófilos) e incubar numa placa plana de cultura de tecidos de 150 x 25 mm com uma grelha de 20 mm durante 4 horas a 37 °C 5% CO2. Isso permitirá NETosis.
- Após 4 horas de estimulação, aspire suavemente e descarte o meio, deixando a camada de TNEs e neutrófilos aderida na parte inferior. Não interrompa essa camada.
- Utilizando um total de 15 ml de PBS frio sem Ca e Mg por cápsula, lavar o fundo de cada cápsula pipetando 15 ml de PBS no fundo da cápsula para retirar todo o material aderente do fundo.
- Coletar a solução obtida da lavagem de cada prato (etapa 1.3) em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar por 10 min a 450 x g a 4 ° C. Os neutrófilos e quaisquer células restantes serão granulares no fundo, deixando um sobrenadante rico em TNE livre de células.
- Divida o sobrenadante em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e gire por 10 min a 18.000 x g a 4 ° C. Isso permitirá que todo o DNA seja pulverizado.
nota: A centrifugação em tubos maiores é mais fácil e menos demorada se essas altas velocidades forem atingíveis na centrífuga regular, caso contrário, será necessário dividir os sobrenadantes em tubos menores para usar a microcentrífuga de alta velocidade.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender todos os pellets obtidos em conjunto em PBS gelado até uma concentração correspondente a 2 x10,7 neutrófilos por 100 μl de PBS. Isso produzirá o estoque NET livre de células que pode ser usado para experimentos subsequentes.
- Meça a concentração de DNA na amostra obtida usando espectrofotometria ou uma ferramenta alternativa de quantificação de DNA. Uma concentração adequada na amostra deve variar entre 140 - 180 ng/μl.
