Isolamento da Rede de Células Imunes Gengivais de Blocos de Dentes Murinos

Neste artigo

Resumo

Fonte: Dutzan, N. et al., Isolamento, Caracterização e Exame Funcional da Rede de Células Imunes Gengivais. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento da rede de células imunes gengivais de um modelo de camundongo. A digestão enzimática libera o tecido gengival dos dentes e ossos aderidos, que é digerido mecanicamente, liberando células imunes da gengiva. As células isoladas estão prontas para experimentos imunológicos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Prepare-se com antecedência

Prepare o meio completo: RPMI suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina e 10% de FBS.
Prepare o meio DNase: 50 ml de meio RPMI suplementado com 7,5 μg de DNase (faça fresco, mantenha no gelo o tempo todo).
Prepare o meio de colagenase-DNase: 5 ml de meio DNase mais 3,2 mg / ml de colagenase tipo IV (faça fresco, mantenha no gelo o tempo todo).
Pré-resfriamento da centrífuga a 4 °C.
Incubadora agitadora quente a 37 °C.

2. Isolamento, Dissecção e Isolamento Celular de Blocos Gengivais

Eutanasiar camundongos expondo-os ao CO₂ em uma câmara apropriada, de acordo com as diretrizes do Comitê Consultivo de Pesquisa Animal (ARAC).
Abra a cavidade torácica e abdominal para expor o coração e os órgãos internos. Para perfundir, faça uma incisão na veia cava inferior e perfunda 3 ml de PBS através do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 3 ml com uma agulha de 27 G.
Imobilize o corpo e a cabeça do mouse em uma almofada com o estômago voltado para cima.
Corte cada comissura do lábio em direção ao pescoço com uma tesoura, separando a pele que cobre a mandíbula e a região do pescoço e expondo os tecidos e músculos subjacentes. Disseque o lábio inferior para descobrir a mandíbula.
Corte entre os incisivos inferiores para separar os dois lados da mandíbula e imobilize cada lado para acessar a cavidade oral.
Visualize e disseque o palato longe da cavidade nasal.
Dissecar áreas com lâmina 10 e incluir áreas molares superiores e inferiores com gengiva circundante (Figura 1). Faça incisões verticais logo anteriores ao primeiro molar e posteriores ao terceiro molar e uma incisão horizontal na borda da gengiva (colarinho branco do tecido ao redor dos dentes).
Coloque os bloqueios maxilar e mandibular em um tubo cônico de 50 ml com 5 ml de colagenase / DNase (mantenha no gelo).
Incubar em uma incubadora agitadora a 37°C por 1 hora e durante os últimos 5 minutos de incubação adicionar 50 μl de EDTA 0,5 M.
Adicione 5 ml de meio DNase frio ao tubo de 50 ml com lenços de papel e agite suavemente para misturar.
Transfira os 4 blocos de tecido para uma placa de Petri e cubra-os com 500 μl de meio DNase. Remova a gengiva de cada bloco de tecido, usando uma lâmina de bisturi e apontando a lâmina para as áreas gengival e interdental.
Transferir os tecidos e os meios da placa de Petri, bem como os meios DNase anteriores utilizados durante a dissecção, para um novo tubo de 50 ml através do filtro de células (tamanho de 70 μm). Lave com meio DNase (3-5 ml) todos os instrumentos utilizados e filtre.
Usando o êmbolo de uma seringa estéril de 3 ml, amasse o tecido contra o filtro, filtrando com meio DNase frio (30 a 35 ml).
Lave o filtro de células com mídia DNase fria.
Centrifugar a 4 °C, 314 x g durante 6 min.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspendê-lo em 1 ml de meio completo.
Conte as células (a quantidade esperada deve variar entre 8 x 10⁵ a 1,2 x 10⁶ células com viabilidade de >80%) usando um contador de células automatizado.

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Resultados

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Figura 1: Isolamento da gengiva murina. Ilustração demonstrando as bordas da dissecção na maxila e o segmento gengival isolado a ser utilizado para dissecção do tecido gengival. (B) Segmento da maxila murina (área molar) com um contorno para dissecção em bloco e bloco isolado. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de um segmento molar superior com tecidos gengivais delineados é mostrada em baixa (C) e maior aumento em (D). ...