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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Amostras de tecido pulmonar
NOTA: Para estudos in vivo de tecido pulmonar, estude as amostras após a exposição relevante. A exposição mais relevante para este experimento são os microrganismos infecciosos, principalmente bactérias. As linhagens de camundongos que podem ser usadas para este método são camundongos C57BL / 6 ou BALB / c, com 10 a 12 semanas de idade, peso de 25 a 30 g e machos.
- Eutanasiar camundongos, por meio de uma injeção intraperitoneal de cetamina (400 mg / kg) e xilazina (40 mg / kg). Abra a cavidade torácica e exponha os pulmões e o coração usando pinças cirúrgicas e tesouras.
- Infunda PBS quente usando uma agulha de calibre 21 no ventrículo direito para lavar o sangue dos vasos por 30 s e, em seguida, infunda 10 mL de fixador PLP a 2% por 30 s (no ventrículo direito).
- Use PBS quente (42 ° C) para lavar a cavidade torácica aberta. Intubar a traqueia com uma agulha de calibre 21 e um pedaço de tubo de 0,8 mm cortado à medida e injectar 800 μL de solução de agarose a 3% pré-aquecida (a 42 °C) e de baixo ponto de fusão.
- Amarre a traqueia com seda trançada (4.0 USP). Coloque o fio ao redor da traqueia, logo abaixo do ponto de inserção da cânula, e prenda-o com um simples nó overhand. Para solidificar a agarose, administre PBS gelado ao redor dos pulmões. Remova os pulmões e o coração como um bloco da cavidade torácica usando uma tesoura e dissecção romba. Remova cada pulmão individualmente e fixe-os por 16 h em PLP a 2% ou formalina a 4 ° C.
- Armazenar as amostras em PBS a 4 °C até à secção do tecido.
- Para preparar as amostras de tecido pulmonar, use as etapas a seguir.
- Fixe os tecidos pulmonares (ressecados na etapa 1.1) em formalina tamponada natural a 10% por 24 h em temperatura ambiente. Transfira para etanol a 75% e coloque em um processador de tecidos em um ciclo de 12 h (2,5 h em EtOH a 75%, 3 h em EtOH absoluto, 3,5 h em solvente 3B e 3 h em parafina).
- Incorpore em parafina padrão para criar blocos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) que são armazenados em temperatura ambiente.
nota: Nesta fase, geralmente é conveniente cortar as seções pulmonares para lâminas padrão.
- Corte as seções pulmonares FFPE com 4 a 5 μm de espessura usando um micrótomo e monte-as em lâminas revestidas carregadas.
- Para montar slides, coloque 3 gotas de meio de montagem em lamínulas de 60 mm x 24 mm (tamanho 1,5), inverta a corrediça na lamínula e empurre o excesso de meio. Sele-os hermeticamente com esmalte e guarde-os em temperatura ambiente.
2. Preparação/Microscopia de Amostras de Tecido Pulmonar
- Para descerar, reidratar e pré-tratar a amostra de tecido pulmonar FFPE com solução de recuperação de antígeno.
- Seque as lâminas FFPE no forno por 60 min a 60 °C. Em seguida, coloque as lâminas em solução de xileno por 30 min e transfira para solução de etanol a 70% por 5 min em temperatura ambiente. Enxágüe em água da torneira.
- Coloque em filme plástico à prova de calor e sujeito à recuperação do antígeno HIER em uma panela de pressão por 10 min em 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Deixe esfriar por 20 min. Lave duas vezes em água da torneira por 5 min em um balancim e depois uma vez com PBS em um balancim.
- Bloqueie com soro de frango a 10% em BSA/PBS a 5% por 30 min em temperatura ambiente.
- Manchar o tecido.
- Para definir METs em macrófagos, adicione anticorpos primários (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 1% BSA/PBS por 16 h a 4 °C na diluição de 1/100 (detalhes específicos sobre quantidades de anticorpos estão listados na Tabela de Materiais). Lave duas vezes com PBS por 5 min em uma cadeira de balanço.
- Obtenha detecção fluorescente por incubação com anticorpos secundários correspondentes em 1% BSA/PBS por 40 min à temperatura ambiente. Os anticorpos são: (1) anti-rato de galinha 488 (verde), (2) anti-cabra de galinha 594 (vermelho) e (3) anti-rato de burro 647 (vermelho distante).
- Lave as seções em PBS e monte-as com um meio de montagem contendo DAPI para coloração de cromatina.
- Obtenha imagens fluorescentes usando um cabeçote de varredura a laser confocal conectado a um microscópio invertido.
- Excite a preparação com lasers de 405, 488, 561 e 647 nm. Capture imagens de plano único de 512 x 512 pixels clicando no botão de nivelamento sequencial de linha (média de 2 linhas) usando objetivas de ar de 20 x 0,1 NA e 40 x 1,0 de óleo de NA.
- Obter pelo menos dez campos de visão por seção para análise e dados para cada resultado (ou seja, 10 campos de visão de alta potência (VOAF) para o controle, 10 para a amostra estimulada, etc., para cada camundongo).
nota: Para obter uma amostra representativa de todo o campo, um sistema de matriz pode ser usado no qual o campo é dividido em diferentes seções e, para cada amostra diferente, a mesma matriz é usada para selecionar os campos de visão (por exemplo, o campo pode ser dividido em 9 seções e, a partir do centro e dos 4 cantos, dois HFOV são tomados).